Мониторинг активации рецепторов запаха в рекомбинантных клетках в режиме реального времени

Аннотация

Источник: de March, C. A. et. al., Мониторинг in vitro активации рецептора запаха одорантом в фазе пара в режиме реального времени. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует метод мониторинга активации рецепторов запаха в рекомбинантных клетках млекопитающих в режиме реального времени с помощью измерения люминесценции. Связывание с одорантом запускает активацию G-белка и выработку цАМФ, активируя глосенсорные белки, которые излучают люминесценцию при связывании с субстратом, обеспечивая количественную меру рецепторной реакции.

Протокол

1. Hana3A Cells Culture

1. Приготовьте M10 (минимальное необходимое средство (MEM) плюс 10 % v/v фетальной бычьей сыворотки (FBS)) и M10PSF (M10 плюс 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина и 1,25 мкг/мл амфотерицина B).
2. Культивируйте клетки в 10 мл M10PSF в 100-миллиметровой чашке для культивирования клеток в инкубаторе, установленном при 37 °C и 5% углекислом газе (CO2).
3. Делите клетки каждые 2 дня в соотношении 20%: когда под фазово-контрастным микроскопом наблюдается 100% слияние клеток (примерно 1,1 x 10⁷ клеток), наберите среду и осторожно промойте клетки 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
4. Аспирируйте PBS и добавьте 3 мл 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 0,48 мМ). Дайте действовать примерно 1 минуту, пока клетки не диссоциируют с пластиной.
5. Добавьте 5 мл M10, чтобы инактивировать трипсин и в конечном итоге отделить клетки, все еще прикрепленные к пластине, пипетируя вверх и вниз.
6. Перенесите объем (8 мл) в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 200 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5 мл M10PSF, пипетируя вверх и вниз, чтобы разбить любую клеточную массу. Избегайте образования пузырей в пробирке.
7. Перелейте 1 мл раствора ресуспендированных клеток в новую 100-миллиметровую чашку для клеточной культуры и добавьте 9 мл свежего M10PSF. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2.

2. Подготовка клеток к трансфекции

1. Оцените слияние или количество клеток, наблюдая за ними под фазово-контрастным микроскопом. Для одной пластины необходимо не менее 10% слияния (примерно 1,1 х 10⁶ клеток).
2. Аспирируйте среду и аккуратно промойте клетки 10 мл PBS. Асасируйте PBS и добавьте 3 мл ЭДТА. Дайте действовать примерно 1 минуту при комнатной температуре, пока клетки не диссоциируют с пластиной.
3. Добавьте 5 мл M10, чтобы инактивировать трипсин и в конечном итоге отделить клетки, все еще прикрепленные к пластине, пипетируя вверх и вниз. Переложите объем (8 мл) в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут.
4. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5 мл M10PSF, пипетируя вверх и вниз, чтобы разбить любую клеточную массу. Избегайте образования пузырей в пробирке.
5. В зависимости от количества трансфицируемых пластин, перенесите соответствующее количество клеток в резервуар с соответствующим объемом M10PSF. Один 96-луночный планшет должен быть покрыт 1/10 100% сливающейся 100-миллиметровой чашки (приблизительно 1,1 x 10⁶ клеток), разведенной в M10PSF, чтобы получить общий объем 6 мл. Для одного 96-луночного планшета, начиная со 100% чашки со 100% слиянием 100 мм, добавьте 500 мкл из 5 мл ресуспендированных клеток в 5,5 мл свежего M10PSF. Смешайте элементы и M10PSF без образования пузырьков воздуха.
6. Пипетка 50 мкл взвешенных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать в течение ночи при 37 °C и 5 %_CO2.

3. Plasmid Transfection

1. Рассмотрите 96-луночный планшет под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в слиянии клеток от 30% до 50%.
2. Приготовьте первую смесь для трансфекции, содержащую плазмиды, общие для всей пластины (более короткая версия рецептор-транспортного белка 1 (RTP1S), обонятельного рецептора (OR) и белка Glosensor; см. Таблицу материалов) в соответствии с объемами, указанными в таблице 1. Обратите внимание, что количество ИЛИ, помеченных Rho, должно быть разделено на количество ИЛИ, если их несколько.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем добавить в план эксперимента пустой векторный отрицательный контроль (в данном случае Rho-pCI) и любой положительный контроль (ИЛИ, о котором известно, что он реагирует на тестируемый одорант).
3. Приготовьте вторую смесь для трансфекции, содержащую 500 μL MEM и 20 μL реагента Lipofectamine 2000 (действительно для одного 96-луночного планшета, см. Таблицу материалов). Добавьте вторую смесь к первой, аккуратно перемешайте пипеткой вверх и вниз и выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавьте 5 мл M10 и аккуратно перемешайте.
4. Замените M10PSF в ранее покрытой 96-луночной пластине на 50 μL окончательной среды для трансфекции. Инкубируйте в инкубаторе, настроенном на 37 °C и 5%_CO2, и пропылесосьте камеру люминометра на ночь.

4. Substrate Incubation

1. Рассмотрите 96-луночный планшет под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в слиянии клеток от 60% до 100%. Приготовьте симуляционный раствор сбалансированной соли Хэнка (HBSS), содержащий 10 мМ гидроксиэтилпиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) и 5 мМ D-глюкозы.
2. Разбавьте 75 μL раствора реагента циклического аденозинмонофосфата (cAMP) (см. Таблицу материалов) до 2,75 мл раствора для стимуляции. Удалите трансфекционную среду из 96-луночного планшета и промойте клетки, добавив в каждую лунку по 50 мкл свежего раствора для стимуляции.
3. Удалите раствор для стимуляции и добавьте 25 μL раствора реагента cAMP, приготовленного на шаге 4.2, в каждую лунку. Инкубируйте 96-луночный планшет при комнатной температуре в темноте и без запаха (например, в чистом пустом ящике вдали от химикатов или любых источников запаха) в течение 2 часов.

5. Стимуляция запаха

1. Сначала уравновесьте камеру люминометра летучими молекулами одоранта. Разведите одорант до нужной концентрации в 10 мл минерального масла (рис. 1А). Перед окончанием инкубации реагента цАМФ добавьте 25 мкл раствора одоранта в новую 96-луночную пластину (не ту, в которой находятся клетки). Инкубируйте эту одорантную пластину при комнатной температуре в камере люминометра в течение 5 минут (рис. 1B) (запись с помощью люминометра здесь не требуется).
2. Настройте люминометр на запись люминесценции с задержкой 0 с в течение 20 циклов измерения пластины по 90 с интервалом 0,7 с между циклами.
3. Прямо перед чтением пластины извлеките пластину с запахом из камеры. Добавьте 25 мкл одоранта между лунками 96-луночного планшета, содержащего элементы (не добавляйте одорант в лунки, содержащие элементы) и быстро начните измерение люминесценции всех лунок в течение 20 циклов в течение 30 минут (рис. 1C).

Таблица 1: Микс для трансфекции. Количество плазмид (белок Glosensor, RTP1S и OR) для добавления в MEM для трансфекции в один 96-луночный планшет.

	На 96-луночный планшет
MEM	500 μL
pGlosensor	10 нг
RTP1S	5 нг
OR	75 нг

 

Результаты

Рисунок 1: Схематические протоколы для мониторинга активации рецепторов одоранта парами одоранта в режиме реального времени. Одорант (фиолетовый) разбавляли до желаемой концентрац...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), феноловый красный - хранить при 4 °C
100 мм тарелка для клеточной культуры	BD Falcon	353003	100 мм x 20 мм тарелка
15 мл tube	BD Falcon	352099	17 мм x 120 мм конические трубки
96-well plate	Corning	3843	96 ну, с крышкой LE белой с прозрачным дном Poly-D-лизиновым покрытием из полистирола
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 μg/mL - хранить при 4 °C
Центрифуга	Jouan	C312	Центрифуга-машина с качающимся ротором ковша для 15 мл
Вытяжной шкаф класса II типа A/B3	NUAIRE	NU-407-500	Fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	Фетальная сыворотка крупного рогатого скота - хранить при -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega<	GloSensor cAMP Reagent люминесцентный белковый субстрат - хранить при -20 °C
Инкубатор 37 °C; 5 % углекислый газ	Fisher Scientific	11-676-604	Инкубатор для культивирования клеток
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml реагент для трансфекции - хранить при 4° C
Люминометр POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader для люминесценции
Минеральное масло	Sigma	M8410	Растворитель для одорантов - хранить при комнатной температуре
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle с солями Эрла и L-глутамином - хранить при температуре 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P43333	Promega	E2301	Leica	090-131.001	RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 нг/мкл плазмиды -

для клеточной культурыtd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>E1290 хранить при температуре 4°C