Мониторинг активации рецепторов запаха в рекомбинантных клетках в режиме реального времени

Аннотация

Источник: de March, C. A. et. al., Мониторинг in vitro активации рецептора запаха одорантом в фазе пара в режиме реального времени. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует метод мониторинга активации рецепторов запаха в рекомбинантных клетках млекопитающих в режиме реального времени с помощью измерения люминесценции. Связывание с одорантом запускает активацию G-белка и выработку цАМФ, активируя глосенсорные белки, которые излучают люминесценцию при связывании с субстратом, обеспечивая количественную меру рецепторной реакции.

Протокол

1. Hana3A Cells Culture

1. Приготовьте M10 (минимальное необходимое средство (MEM) плюс 10 % v/v фетальной бычьей сыворотки (FBS)) и M10PSF (M10 плюс 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина и 1,25 мкг/мл амфотерицина B).
2. Культивируйте клетки в 10 мл M10PSF в 100-миллиметровой чашке для культивирования клеток в инкубаторе, установленном при 37 °C и 5% углекислом газе (CO2).
3. Дел....

Результаты

Рисунок 1: Схематические протоколы для мониторинга активации рецепторов одоранта парами одоранта в режиме реального времени. Одорант (фиолетовый) разбавляли до желаемой концентрац.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), феноловый красный - хранить при 4 °C
100 мм тарелка для клеточной культуры	BD Falcon	353003	100 мм x 20 мм тарелка
15 мл tube	BD Falcon	352099	17 мм x 120 мм конические трубки
96-well plate	Corning	3843	96 ну, с крышкой LE белой с прозрачным дном Poly-D-лизиновым покрытием из полистирола
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 μg/mL - хранить при 4 °C
Центрифуга	Jouan	C312	Центрифуга-машина с качающимся ротором ковша для 15 мл
Вытяжной шкаф класса II типа A/B3	NUAIRE	NU-407-500	Fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	Фетальная сыворотка крупного рогатого скота - хранить при -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega<	GloSensor cAMP Reagent люминесцентный белковый субстрат - хранить при -20 °C
Инкубатор 37 °C; 5 % углекислый газ	Fisher Scientific	11-676-604	Инкубатор для культивирования клеток
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml реагент для трансфекции - хранить при 4° C
Люминометр POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader для люминесценции
Минеральное масло	Sigma	M8410	Растворитель для одорантов - хранить при комнатной температуре
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle с солями Эрла и L-глутамином - хранить при температуре 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P43333	Promega	E2301	Leica	090-131.001	RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 нг/мкл плазмиды -

для клеточной культурыtd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>E1290 хранить при температуре 4°C