Индуцирование образования тромбов в мозге мыши с помощью светочувствительного красителя

Аннотация

Источник: Talley Watts, L., et al. Фототромбоз розовой бенгалии с помощью конфокальной оптической визуализации in vivo: модель инсульта одного сосуда. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует технику индуцирования образования тромбов в мозге мыши. Мышь под наркозом с черепным окном и истонченным черепом подвергается фототромбозу путем активации светочувствительного красителя с помощью света высокой интенсивности. В этом процессе образуются активные формы кислорода, которые повреждают стенки сосудов и вызывают образование тромбов, в конечном итоге препятствуя притоку крови к мозгу.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Обезболивание для коркового препарата

1. Поместите мышь в индукционную камеру с 2-3% изофтораном, смешанным с кислородом, чтобы вызвать анестезию. Наблюдайте за снижением частоты дыхания по мере индуцирования мыши. Сожмите мышь за лапу, чтобы определить, готова ли мышь двигаться к носовому конусу. Примечание: Уровень анестезии является критическим этапом в любой подготовке in vivo, и следует соблюдать осторожность, чтобы не вызвать уровень, который вызовет глобальную ишемию.
2. Как только мышь будет достаточно обезболиваена, перенесите животное на операционную/визуальную платформу, поместите нос мыши в носовой конус и нанесите 1-1,2% изофторана для поддержания обезболивающего состояния. Убедитесь, что мышь лежит на грелке с регулируемой температурой, чтобы поддерживать температуру тела (37°C +/- 0,5°C) на протяжении всех остальных процедур. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
3. Контролируйте физиологию мыши с помощью системы пульсоксиметрии с помощью зажима для хвоста или ноги, входящего в комплект поставки системы. Следите за тем, чтобы частота дыхания поддерживалась в пределах 50-65 вдохов/мин. Убедитесь, что частота сердечных сокращений остается в диапазоне от 300 до 450 уд/мин, а сатурация кислорода поддерживается на уровне 97-98%, чтобы обеспечить долгосрочную выживаемость животного.
4. Когда мышь будет адекватно обезболиваена, сбрейте шерсть над черепом с помощью электрических машинок для стрижки, удалите остатки волос и очистите их бетадином, после чего смойте тампоном из этанола. Повторите эту процедуру до трех раз, чтобы обеспечить стерильную хирургическую среду.

2. Хирургическое вмешательство

1. }Полностью очистив и выбритую кожу головы, сделайте 5-миллиметровый разрез на коже головы мыши, чтобы выявить черепные трещины и локализовать брегмы.
2. С помощью стерильного ватного аппликатора удалите остатки фасции, расположенные над черепом.
3. Приклейте изготовленное на заказ кольцо из нержавеющей стали (Рисунок 1) с тканевым клеем к кости, расположенной над теменной корой, используя стереотаксические координаты Bregma: от -1 до -3 мм и латеральные: 2-4 мм. Примечание: Клей обычно схватывается в течение 2 минут после установки кольца на кость.
4. Прикрепите кольцо к стереотаксическому держателю (Рисунок 2), чтобы стабилизировать мышь и предотвратить движение во время визуализации.
5. Под хирургическим препарирующим микроскопом медленно просверлите срез 1-2 мм в черепе с помощью инструмента с регулируемой скоростью (сверло Meisinger 3,9 мм), следя за тем, чтобы область оставалась ровной во время сверления. Добейтесь этого с помощью зигзагообразного узора. Чтобы избежать нагрева, установите низкую скорость бурения и делайте частые перерывы.
6. Когда череп черепа станет блестящим на вид, продолжайте истончение черепа с помощью лезвия скальпеля с использованием той же зигзагообразной схемы, чтобы сохранить истонченную поверхность ровной и облегчить гладкое удаление тонких слоев черепа черепа. С помощью кончика лезвия скальпеля делайте небольшие линейные мазки с легким нажимом, чтобы удалить тонкие слои кости за один раз. Продолжайте до тех пор, пока сосудистая сеть не станет хорошо видна в препарирующий микроскоп.
7. Если экспериментатор проколет или сломает череп в процессе истончения, усыпьте животное из-за вероятного повреждения нижележащей коры.
   Примечание: Череп мыши имеет толщину около 300 мкм и состоит из двух тонких слоев компактной кости (один внешний и один внутренний) и слоя губчатой кости, зажатого между двумя слоями компактной кости. Внешний слой компактной кости и большая часть губчатой кости удаляются в пределах 5-миллиметровой зоны сверления, в результате чего остается слой компактной кости размером примерно 50 мкм (см. Рисунок 2B). Визуализация сосудистой сети гарантирует, что окончательный неповрежденный истонченный череп будет иметь толщину примерно 50 мкм. Таким образом, череп все еще присутствует при истончении до этой толщины.

3. Настройка микроскопа

1. Используйте инвертированную микроскопическую систему (обычную, конфокальную или двухфотонную системы) с объективным инвертором. Примечание: Также можно использовать стандартный вертикальный микроскоп. Ограничивающим фактором будет пространство между сценой и целями. Для выполнения этой настройки могут потребоваться модификации рабочей области.
2. Закрепите операционную/визуализирующую платформу на изготовленном по индивидуальному заказу предметном столике, расположенном рядом с основанием микроскопа. Примечание: Платформа изготовлена с использованием лабораторного домкрата для вертикального перемещения хирургической/визуализационной платформы под объективом. Лабораторный домкрат крепится к пластине, прикрепленной к четырем цилиндрическим полюсам. (См. Рисунок 2).
3. Расположите инвертор объектива, содержащий 20-кратный объектив, над краниальным окном. Используйте внешний источник света, чтобы найти краниальное окно, глядя через окуляры микроскопа, и расположите объектив в области визуализации. Примечание: Область визуализации будет обозначена наличием сосудистой сети.
4. Для целей на водной основе используйте искусственную спинномозговую жидкость (ФКБ) (130 мМ NaCl; 30 мМ KCl; 12 мМ KH₂PO₄; 200 мМ NaHCO₃; 30 мМ гидроксиэтилпиперазина этановой сульфоновой кислоты [HEPES]; и 100 мМ глюкозы) в качестве среды из-за потенциальной утечки в полость черепа во время визуализации (Рисунок 3).

4. Розовый бенгальский краситель приготовление, введение и индукция инсульта

1. Приготовьте свежий 20 мг/мл раствора розовой бенгалии в КОКФ; Перед введением процедить и простерилизовать. Не используйте повторно и не храните Розовую Бенгалию после смешивания. Для каждого эксперимента вносите свежее решение.
2. Введите 0,1 мл инъекции Розовой Бенгалии в хвостовую вену во время сканирования черепного окна с помощью лазера с длиной волны 561 нм, чтобы обеспечить адекватное введение раствора. Примечание: Розовый бенгальский будет визуализирован в течение 5 секунд после инъекции в сосудистую сеть головного мозга. Весь сосуд должен быть наполнен Розовой Бенгалией.
3. После адекватного введения розового бенгальского красителя выберите подходящий сосуд для тромбоза в зависимости от диаметра сосуда (40-80 мкм), чтобы обеспечить воспроизводимость конкретного объема поражения. Различайте артерии и вены, глядя на направление кровотока: артерии будут двигаться от сосудов большего диаметра к сосудам меньшего диаметра, вены будут двигаться от сосудов меньшего диаметра к сосудам большего диаметра. Это легко достигается с помощью визуализации после введения Rose Bengal.
4. Измените настройку микроскопа следующим образом:
   1. Увеличьте время пребывания. Примечание: Это зависит от используемой системы микроскопа.
   2. Увеличьте мощность лазера до 100%.
   3. Собирайте изображения временной последовательности со скоростью 1 кадр/сек, используя максимальную скорость сканирования.
5. Сканируйте мышь до тех пор, пока внутри сосуда не образуется устойчивый сгусток. Примечание: Обычно это достигается в течение 5 минут после непрерывного сканирования (см. Рисунок 4).
6. После индукции образования тромба с помощью Rose Bengal удалите мышь из области визуализации обратно в микроскоп для препарирования. Осторожно снимите кольцо из нержавеющей стали с черепа черепа. Осмотрите окно черепа на предмет кровотечения. Если произошло кровотечение, прекратите эксперимент.
7. Используйте монофиламентный шов 6.0, чтобы закрыть разрез над черепом. Поместите мазь с антибиотиком вдоль линии наложения шва, чтобы предотвратить инфицирование. Вводите бупренекс (0,05 мг/кг) подкожно каждые 12 часов в течение трех дней для снятия боли.
8. Верните мышь в восстановительную камеру после извлечения из анестетика до тех пор, пока она полностью не придет в себя и не будет свободно двигаться.
9. Верните мышь в чистую клетку для дальнейшего исследования в более позднее время.

Результаты

Рисунок 1: Кольцо из нержавеющей стали. Показаны три вида (сверху, сбоку и снизу) держателя кольца из нержавеющей стали, который прикладывается к черепу мыши для крепления его к стереотаксическому держателю.

Материалы