Моделирование регенерации сенсорных аксонов у крысы с помощью инъекции ганглия дорсального корешка и травмы дробления дорсального корешка

Аннотация

Источник: Cheah, M., et al. Инъекция ганглия дорсального корешка и травма дробления дорсального корешка как модель сенсорной регенерации аксонов. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео показана пошаговая процедура введения вирусной суспензии в ганглии дорсальных корешков (DRGs) и индуцирования контролируемого повреждения аксонов путем дробления дорсального корешка у крысы под наркозом. Протокол включает в себя воздействие DRG, доставку вирусного вектора, способствующего росту, для облегчения регенерации аксонов, и разрыв аксональных связей со спинным мозгом для моделирования повреждения сенсорных нервов и регенерации.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Инъекция DRG и выполнение травмы дорсального корня

ПРИМЕЧАНИЕ: Это чрезвычайно деликатная операция. Рекомендуется сначала попрактиковаться на нескольких мертвых животных, чтобы ознакомиться с анатомией, прежде чем переходить к хирургии живых животных.

1. Найдите выступающие С2 и Т2 остистые отростки на коже. Сделайте разрез кожи между остистыми отростками С2 и Т2 с помощью лезвия скальпеля No 10 (как только кожа будет открыта, на первом слое мышцы должна быть видна белая волокнистая средняя линия; первый слой мышцы имеет «желеобразную» текстуру).
2. Сделайте разрез аналогичного размера на первом слое мышцы по белой средней линии с помощью лезвия скальпеля. Не стоит выходить за пределы выступающего Т2 остистого отростка, так как рядом с ним находится крупная артериальная ветвь от нисходящей аорты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное кровотечение может произойти в любом месте, начиная с этого этапа. Всегда останавливайте кровотечение и удаляйте кровь с помощью стерилизованных ватных палочек или хирургических рассасывающихся губок, чтобы обеспечить четкую визуализацию в любое время. Проведение процедуры «вслепую» может привести к нежелательному повреждению спинного мозга, DRG или спинного корешка, что приведет к неожиданным неблагоприятным последствиям у животного в дальнейшем.
3. Втяните первый слой мышцы с помощью двух ретракторов, один из которых расположен рострально, а другой каудально; Должен быть виден второй слой мышцы, с поперечно-полосатым видом.
4. Найдите среднюю линию второго слоя мышц (где можно наблюдать две продольные мышцы, соединенные тонкой пленчатой тканью). Рассеките перепончатую ткань с помощью микроножниц, чтобы разделить две продольные мышцы. По возможности избегайте использования лезвия скальпеля, так как это может привести к ненужному повреждению мышц и кровотечению.
5. Отрегулируйте ретракторы соответствующим образом, чтобы обнажить третий слой тонкой мышцы, покрывающей позвоночник. Остистые отростки можно прощупать, слегка прикоснувшись щипцами к третьему слою мышцы.
6. Сделайте небольшой надрез на третьем слое мышцы с помощью микроножниц и аккуратно соскребите мышцу с кости с помощью кюретки или скальпеля сбоку, чтобы четко обнажить позвонки. При необходимости отрежьте часть мышцы или сухожилия, чтобы облегчить ламинэктомию.
7. Чтобы обнажить левую ДРГ С5 - С8, выполните левую геми-ламинэктомию позвонков С4 - Т1, осторожно удалив часть пластинки и ножки с помощью пары тонких ронжеров. ДРГ располагается вблизи поперечного отверстия позвонков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: C3 - C7 позвонки не имеют выраженного остистого отростка. С5 DRG расположен между позвонками С4 и С5, С6 DRG — между позвонками С5 и С6 и так далее, а С8 DRG — между позвонками С7 и Т1. Позвонок С8 отсутствует, несмотря на наличие С8 DRG и сегмента С8 спинного мозга.
8. После того, как достаточное количество DRG будет подвергнуто воздействию для инъекции, подготовьте шприц, поместив заполненный вирусом микролитровый шприц, оснащенный изготовленной на заказ тупой иглой 33-го калибра, на стереотаксический держатель шприца. Перед инъекцией используйте иглу 30-го калибра со скошенным углом, чтобы сделать небольшое поверхностное отверстие на каждом из целевых DRG, чтобы облегчить введение инъекционной иглы.
9. Вставьте стрелку 33-го калибра в центр DRG, осторожно поворачивая ручки, чтобы отрегулировать стереотаксические координаты. Не вставляйте иглу слишком сильно, так как это может привести к вытеканию жидкости с подфюзеляжной стороны DRG. В случае возникновения утечки немедленно отрегулируйте положение иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Числовые стереотаксические координаты не используются; Тем не менее, полезно использовать раму для удержания иглы для инъекции.
10. Введите по 1 мкл вируса в каждую DRG со скоростью 0,2 мкл/мин с помощью инфузионного шприцевого насоса. Подождите еще три минуты, прежде чем вынимать иглу. Во время инъекции ДРГ будет медленно менять цвет, если раствор вируса содержит цветной краситель.
11. Чтобы выполнить одновременную травму дорсального корешка C5 - C8, раздавите каждый корень три раза в течение 10 с с помощью пары щипцов с тонким наконечником (Bonn Micro), полностью противопоставляя концы щипцов; В месте раздавливания в ткани должна появиться белая линия. Не углубляйтесь щипцами глубже, чем требуется, так как это может привести к повреждению вентрального корешка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	Для визуализации бесцветного решения. Рекомендуемая концентрация: 1%
Держатель иглы Олсена-Хегара	Fine Science Tools	FST 12502-12
Изогнутая чашка Фридмана Пирсона Ронгера 0.7 мм	Fine Science Tools	FST 16121-14
Bonn Micro Щипцы	Fine Science Tools	FST 11083-07	Для выполнения травмы дробления дорсального корня
Ножницы для разделения тканей
Fine Science Tools	FST 14072-10
Тонкие ножницы	Инструменты для тонкой науки.	FST 14058-11
Micro-Adson Щипцы Микро-Адсона	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03	<
Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Ethicon	1972	For bleeding control
Микролитровый шприц RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
Изготовленная на заказ съемная игла (для инъекции DRG)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 38 mm, point style 3
UltraMicroPump с контроллером SYS-Micro4	World Precision Instruments	UMP3-1

td style='border-top-style:none;height:15.5pt;width:208pt;'>Весенние ножницы Vannas (прямые)