Оценка целостности гематоэнцефалического барьера на модели крысы с лазерно-индуцированным повреждением головного мозга

Аннотация

Источник: Kuts, R. et al. Лазерно-индуцированное повреждение головного мозга в моторной коре головного мозга крыс. J. Vis. exp. (2020)

Это видео демонстрирует оценку целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) после лазерно-индуцированного повреждения головного мозга у крыс. В хвостовую вену вводится краситель для слежения, что позволяет ему циркулировать в мозге и проникать в ткани через поврежденный ГЭБ. Затем мозг извлекается и обрабатывается для высвобождения красителя. Интенсивность флуоресценции красителя измеряется для количественной оценки степени повреждения ГЭБ, вызванного лазером.

Протокол

Все процедуры, связанные с моделями животных, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Лазерно-индуцированная травма мозга экспериментальная процедура

1. Назначьте 20 крыс в группу, помеченную как лазерная группа, и 20 крыс в другую контрольную группу (искусственно оперированную).
2. Подвергните крыс лазерной группы лазерному облучению с температурой 50J X 10 следующим образом:
   1. Обезболите крысу смесью 2% изофлурана в кислороде, обеспечивая спонтанную вентиляцию. Проверьте достаточную глубину анестезии, зажав хвост щипцами, чтобы увидеть отсутствие рефлекса отмены.
   2. Поддерживайте температуру тела крысы на уровне 37 °C на протяжении всей экспериментальной процедуры с помощью ректальной грелки.
   3. Удалите локальные волосы с помощью бритвы и продезинфицируйте 70% спиртом и 0,5% глюконатом хлоргексидина. Повторите этап дезинфекции еще два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер хирургического разреза должен быть примерно 3 см. Удалите волосы не менее чем на 2 см вокруг области разреза.
   4. Поместите крысу на стереотаксический держатель для головы в положении лежа и сделайте разрез 3 см, чтобы отразить кожу головы в боковом направлении и обнажить область между Брегмой и Лямбдой.
   5. Поддерживайте анестезию через носовой конус.
   6. Используйте лазер на иттрий-алюминиевом гранате (Nd-YAG), легированный неодимом, (пиковая длина волны 1064 нм) для введения 50J X 10 точек, с длительностью импульса 1 с, в открытую область черепа над правым полушарием.
   7. Убедитесь, что генерирующая лазер часть устройства находится на расстоянии 2 мм от открытой области для создания лазерного луча. 50J X 10 точек были выбраны после тщательной оценки различных комбинаций энергии/поверхности. Эта комбинация эффективна и не вызывает разрушения костей черепа после введения менее чем на секунду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2 мм - это расстояние между выводом лазерного луча (через который он проходит от оптического кабеля) и костью черепа. В случае, если используется фокусирующая линза, расстояние должно быть рассчитано с учетом угла наклона линзы для фокусировки луча в желаемой области повреждения. Обеспечьте надлежащую безопасность при использовании лазерного устройства, включая соответствующую подготовку и защиту глаз.
   8. Извлеките крысу из устройства и закройте кожу головы шелковыми хирургическими швами 3-0.
   9. Прекратите анестезию и верните крысу в клетку для восстановления. Введите 0,1 мл 0,25% бупивакаина местно, чтобы уменьшить послеоперационную боль сразу после операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна длиться менее 5 минут при правильном выполнении.
3. Наблюдайте за крысой на предмет любых признаков дистресса во время восстановления после анестезии. Перед выходом из анестезии введите 0,01 мг/кг внутримышечно бупренорфин для послеоперационной анальгезии и продолжайте принимать повторные дозы каждые 12 ч в течение не менее 48 ч.
4. Подвергайте крыс контролю в тех же условиях, не подвергая их воздействию лазера.

2. Оценка неврологической тяжести (NSS)

1. Оцените оценку неврологической тяжести через 24 часа после травмы головного мозга, вызванной лазером, используя 43-балльную оценку. Протестируйте животных на неврологические дефициты, поведенческие нарушения, задачу на равновесие луча и рефлексы, назначив более высокие баллы за более серьезные нарушения.

3. Оценка травмы

1. головного мозгаОпределение степени разрыва гематоэнцефалического барьера (BBB)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените поломку BBB через 24 часа после травмы головного мозга, вызванной лазером, следующим образом:
   1. Введите 2% Evans Blue в смеси с 4 мл/кг физиологического раствора внутривенно крысам через канюлированную хвостовую вену и дайте раствору циркулировать в течение 1 часа.
   2. Усыпьте крыс, подвергая их воздействию 20% кислорода и 80% CO₂ (через вдох) через 24 часа после последнего NSS.
   3. Соберите внутрисосудисто локализованный краситель следующим образом:
      1. Откройте грудную клетку крыс хирургическими пинкетами и хирургическими ножницами.
      2. Проведите животных охлажденным 0,9% физиологическим раствором через левый желудочек с использованием 110 мм рт.ст. до получения бесцветной перфузионной жидкости из правого предсердия.
   4. Соберите мозги и нарежьте их ростро-каудально на ломтики по 2 мм.
   5. Отделите срезы левого полушария от правой, чтобы отдельно оценить поврежденные и неповрежденные полушария.
   6. Взвесьте, гомогенизируйте с помощью ступки и пестика, а затем инкубируйте ткани мозга в 50% трихлоруксусной кислоте в течение 24 часов.
   7. Центрифугируйте гомогенизированные срезы мозга при 10,000 × г в течение 20 минут.
   8. Смешайте 1 мл надосадочной жидкости из центрифугированного мозга с 1,5 мл 96% этанола в соотношении 1:3 и оцените разрыв гематоэнцефалического барьера с помощью флуоресцентного детектора на длине волны возбуждения 620 нм (полоса пропускания 10 нм) и длине волны излучения 680 нм (ширина полосы 10 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе группы крыс проходят один и тот же протокол для определения распада BBB.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
50% трихлоруксусная кислота	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Матрицы мозга и тканей	SIGMA - ALDRICH	15013
Canjula Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Центрифуга Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Компактные аналитические весы	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Цифровые весы	SIGMA - ALDRICH	4,000
Ножницы для препарирования	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Пипетка Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Этанол 96 %	ROMICAL		Легковоспламеняющаяся жидкость
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Флуоресцентный детектор	Tecan, Männedorf Switzerland	модель многорежимного считывателя
Нагреватель с термометром	Грелка-1	Модель: ГРЕЛКА-1/2
Инфузионная манжета	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 микроскоп	Olympus
чашки Петри	SIGMA - ALDRICH	P5606
Лезвия скальпеля 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (неодим-легированный иттрий-алюминиевый гранат) лазерный аппарат	Laser Industries Ltd
Стереотаксический держатель головки	KOPF	900LS
Стерильный шприц 2 мл	Braun	4606027V
Игла для шприца 27 G	Braun	305620

рупийInfinite 200 PRO