Флуоресцентная локализация белков плотного соединения и стрессовых волокон в эндотелиальных клетках

Аннотация

Источник: Alluri, H., et al. Кислородно-глюкозное голодание и реоксигенация как модель повреждения ишемии-реперфузии in vitro для изучения гематоэнцефалического барьера. J. Vis. Exp. (2015).

В видеоролике показана флуоресцентная локализация белков плотного соединения и стрессовых волокон в микрососудистых эндотелиальных клетках (RBMECs) головного мозга крыс. В стрессовом монослое флуоресцентно меченые антитела используются для маркировки белков плотного соединения, в то время как фаллоидин, меченный флуорофорами, помечает стрессовые волокна. Затем меченые молекулы визуализируются с помощью конфокальной микроскопии.

Протокол

1. посев эндотелиальных клеток

NOTE:²NOTE:2. Кислородная и глюкозная депривация-реоксигенация (OGD-R) In Vitro Model
1. Используйте систему культивирования клеток гипоксии для изучения влияния OGD-R на RBMECs в (см. Рисунок 1). Перед началом эксперимента настройте и откалибруйте систему культивирования клеток гипоксии в соответствии с инструкциями производителя.
2. ₂ и 5% CO₂ в течение 2 часов при 37 °C, чтобы представить состояние OGD.
3. ₂, 5% CO₂NOTE: Этот шаг представляет собой ситуацию с реоксигенацией.
4. 3. Иммунофлуоресцентная локализация zonula occludens-1 (ZO-1) и филаментозного актина (f-actin) маркировка с использованием родаминового фаллоидина
   1. Выдержите предметные стекла камеры, содержащие монослои RBMEC, до 100 μл opti-MEM/уменьшенной сывороточной среды/лунки на 1 час. Промойте предметные стекла камеры 3 раза в 100 μл фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,0-7,2).
   2. f-actin.
      1. Для иммунофлуоресцентного окрашивания инкубируйте клетки с первичным антителом против кролика против ZO-1 в масштабе 1:150, приготовленным в 2% BSA-PBS для ночного использования (O/N) при 4 °C. Промойте клетки 3 раза в PBS (pH 7,0-7,2). Инкубировать со 100 мкл меченного флуоресцеином изотиоцианата (FITC) вторичного антитела против кролика в течение 1 часа при комнатной температуре (ОТ).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 хорошо стерильные, стеклянные слайды	Thermo scientific	177402
FITC-помеченный анти-кролик вторичный антитело	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Можно использовать любой другой доступный PBS