Модель минимального повреждения спинного мозга для изучения активации и миграции нейральных стволовых клеток

Аннотация

Источник: Лакшман, Н., et al. Нейросферный анализ для оценки активации эндогенных нейральных стволовых клеток в мышиной модели минимального повреждения спинного мозга. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется активация и миграция нейральных стволовых клеток (НСК) в модели травмы спинного мозга у мыши. Чтобы обнажить спинной мозг, у мыши, находящейся под наркозом, удаляют позвонок из грудного отдела позвоночника. Затем в белом веществе спинного мозга создается поверхностная травма с помощью изогнутой иглы, которая сохраняет центральный канал. После травмы НСК, окружающие канал, активируются и мигрируют к месту повреждения, способствуя восстановлению тканей.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Минимальное повреждение спинного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией убедитесь, что все хирургические инструменты и материалы стерилизованы соответствующими методами (Рисунок 1A).

1. Постройте грудную опорную арку, свернув 4–5 квадратов марли и скрепив их вместе посередине, чтобы получить фиксированный рулон марли.
2. Поместите мышь в индукционную камеру и начните анестезию 5% изофлураном. Подтвердите отсутствие рефлекса щипкового рефлекса пальцев ног перед тем, как приступать, а также на протяжении всей процедуры. Поскольку операция может занять более 30 минут, оптимизируйте ее для минимальной экспозиции изофлурана (5 минут при 5% и оставшееся время при 2–3%).
3. Перенесите мышь в носовой конус, прикрепленный к анестезиологическому аппарату в поддерживающей дозе 2–3% изофлурана. Используйте машинки для стрижки шерсти, чтобы удалить шерсть со спины животного от середины спины до шеи/ушей, чтобы обнажить широкий прямоугольный участок кожи для операции.
4. Перенесите мышь на стереотаксический инструмент, поместив ее нос в прикрепленный носовой конус и стабилизируя череп ушными планками. Поддерживайте уровень изофлурана на уровне 5% во время установки ушных дуг и снижайте до 2–3% после того, как мышь закреплена в стереотаксическом устройстве.
5. Внутрибрюшинно вводят предоперационные обезболивающие препараты — мелоксикам (2,0 мг/кг). Обильно нанесите смазывающую жидкость на открытые глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии.
6. Поместите грудную опорную дугу под брюшную полость мыши, одновременно выпрямляя тело и позвоночник мыши, слегка потянув за основание хвоста. Используйте лабораторную маркировочную ленту, чтобы зафиксировать хвост и все вытянутые конечности в положении звезды. Закрепив его, надавите на опорную дугу грудной клетки рострально, от брюшка мыши к верхней части грудной клетки, чтобы подпереть грудной отдел позвоночника (Рисунок 1B).
7. Подготовьте стерильное операционное поле, продезинфицировав участок кожи, подстриженный шерстью, подготовленный на шаге 1.3, 70% этанолом, а затем повидон-йодом. Повторите дважды. Наложите стерильную хирургическую простыню, чтобы сохранить широкое стерильное поле.
8. С помощью лезвия скальпеля #10 сделайте вертикальный разрез параллельно продольной оси животного от середины обеих лопаток до изгиба грудного отдела позвоночника. Втяните кожу, чтобы обнажить мягкие ткани и контур позвоночного столба (Рисунок 1C).
9. Определите нижнюю границу надлопаточного жирового пакета (это разграничивает уровень позвонков T4/5). Тем же лезвием #10, аккуратно, но с силой, разрежьте вдоль обеих сторон позвоночной кости T5–T8/9, чтобы оторвать сухожилия задней мышцы от колонны.
10. Вставьте зубья ретракторов в места разрезов по обе стороны от позвоночника. Отрегулируйте экспозицию, расширив ретракторы, чтобы достаточно поднять позвоночник, не оказывая слишком большой нагрузки на втянутые мышечные слои (Рисунок 1D).
11. Под операционным микроскопом тщательно очистите остаточные мышцы и другие мягкие ткани, расположенные над позвоночником, чтобы обнажить позвоночную кость (Рисунок 1E). Определите позвонки, которые будут удалены, обхватив остистый отросток позвонков зубчатыми щипцами и слегка перемещая его вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно позволить идентифицировать межпозвоночные суставы и выявить небольшие отверстия (межпозвоночные отверстия) под интересующими позвонками.
12. Вставьте по одной головке изогнутых тупых ножниц в обе стороны от открытого межпозвоночного отверстия, каудально по отношению к удаляемой пластинке позвонка, и разрежьте соединительные межпозвонковые суставы с обеих сторон.
13. Поднимите пластинку вверх и отрежьте верхнее крепление пластинки, чтобы изолировать и удалить кость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обнажит неповрежденный дуральный мешок, содержащий спинной мозг (Рисунок 1F). Может наблюдаться чрезмерное кровотечение, которое можно контролировать, наложив предварительно разрезанную марлю размером 1 см х 1 см на пораженные участки и/или промыв стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).
14. С помощью дорсальной срединной вены, служащей ориентиром, вставьте согнутый под углом 45° стержень кончика иглы 30 G (со скосом иглы вверх) в дорсолатеральную поверхность спинного мозга (глубиной примерно 1 мм) примерно на 0,5 мм латерально по обе стороны от средней линии.
15. Переместите иглу на ~2 мм от каудальной к ростральной (параллельно средней линии) так, чтобы в шнур была введена вся длина скоса иглы. Удалите иглу, выполнив повторную трассировку по пути входа (Рисунок 1G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечения быть не должно, но на этом этапе может наблюдаться отек спинномозговой ткани.
16. Чтобы закрыть рану, удалите ретрактор и сшите мышцы спины по обе стороны от раны по средней линии с помощью рассасывающегося шва 6-0. Используйте стерильный шелковый шов 4-0, чтобы впоследствии закрыть вышележащую кожу.

Результаты

Рисунок 1: Хирургическая процедура. (A) Макет всего необходимого, пронумерованный для справки. (B) Изображение мыши в стереотаксическом устройстве с выпрямленным телом, позвоночником и конечностями, разложенными и заклеенными скотчем, а также расположенной под ним грудной дугой. (C) Изображение мыши с вертикальным разрезом кожи, обнажающим мышечный сл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04	<
Fine Science Tools	15370-50	Настроить при заказе, чтобы получить тупые кончики
Graefe Notebook (прямые, 1x2 зуба)	Fine Science Tools	11053-10
Очень тонкие щипцы Graefe (изогнутые, зубчатые)	Fine Science Tools (Straight)<	Или любые другие щипцы для наложения швов
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	Или любой другой подходящий для наложения
Рукоятка скальпеля #3	Fine Science Tools	10003-12	Или любой другой подходящий
Hair clippers	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	или любой другой подходящий
Stereotaxic instrument	Stoeling	51500	или любой другой подходящий
Meloxicam		<
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	или любой другой подходящий
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	или любой другой подходящий для анестезии
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze	Fisher Scientific	13-761-52
30G Иглы	Becton Dickinson	305106	For Injury
25G Needles	Becton Dickinson	305122	Для инъекций
1mL Шприцы-носители.	Becton Dickinson	3090659	для инъекций
3mL Syringes	Becton Dickinson	309657	для инъекций
4-0 Suture	uoftmedstore.com	2297-VS881	для наложения швов на кожу
6-0 Шов	uoftmedstore.com	VS889	для наложения мышечных швов	Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000

td style='height:14.5pt;width:237pt;'>Moria Пружинные ножницы Ваннаса-Вольфа (изогнутые)td style='width:332pt;'>11152-10швовtd style='width:292pt;'>или любой соответствующий санкционированный учреждениемпо уходу за животными наркотиков наркотиков жидкости