В этом видео демонстрируется получение фиксированного альдегида нечеловеческой мозговой ткани приматов с использованием предварительной иммуногистохимии для электронной микроскопии. В нем описаны этапы иммуномаркировки специфического белка нейрона, за которыми следует пероксидазаная реакция, в результате которой образуется окрашенный осадок, позволяющий визуализировать целевой белок в электронной микроскопии.
Методическая статья
Проведение иммуногистохимии на ткани мозга нечеловекообразного примата
858 просмотров
⸱
28 апреля 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Перед внедрением иммуногистохимии (рис. 1C)
- Приготовьте 4 л стокового раствора трис-буферизованного физиологического раствора (TBS, 50 мМ, pH 7,6) следующим образом.
- Отмерьте 2 л дистиллированной воды в стакане объемом 4 л, добавьте 24,23 г тригидроксиметиламинометана (THAM; C4H11NO3) и перемешайте для растворения.
- Отрегулируйте pH до 7,6 с помощью примерно 148 мл 1 Н HCl. Кислоту следует добавлять с осторожностью, чтобы не достичь pH ниже 7,6. Общий объем должен составлять 4 л.
ВНИМАНИЕ: HCl очень коррозионный. Носите соответствующие СИЗ.
- Выберите срезы, содержащие интересующую область для обработки для иммуногистохимии ЭМ.
- Промойте свободно плавающие секции 3 раза в PBS (0,1 M, pH 7,4) в течение 5 минут при RT, чтобы смыть раствор антифриза.
- Приготовьте 0,5% раствор NaBH4, разведенный в PBS.
- Взвесьте 0,05 г NaBH4 и разведите его в 10 мл PBS. Не накрывать. Приготовьте этот раствор непосредственно перед применением.
- Инкубируйте секции в свежеприготовленном растворе NaBH4 в течение 30 минут при RT. Осторожно покачивайте. Не накрывать.
- Промойте 3 раза в PBS в течение 10 минут при RT, энергично покачивая, пока не останется реакционного газа.
- Приготовьте блокирующий раствор для ЭМ с 2% подходящей нормальной сывороткой и 0,5% холодным рыбным желатином, разведенным в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество должно быть рассчитано таким образом, чтобы его хватило для следующих трех шагов. Используйте сыворотку, изготовленную из тех же видов животных, в которых содержится вторичное антитело. Избегайте использования методов извлечения антигена или добавления небольших количеств тритона (для увеличения проникновения антител), так как эти методы значительно ухудшают качество ткани. - Инкубируйте секции в блокирующем растворе в течение 1 ч при RT. Осторожно покачивайте.
- Готовят первичный раствор антитела, разведенный в блокирующем растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация первичного антитела обычно такая же, как и при иммуногистохимии LM, но рассмотрите возможность проведения тестов с различными концентрациями антител заранее, так как некоторые первичные антитела могут не работать с акролеином. Если это так, то можно использовать смесь глутаральдегида (0,1 - 2%) и 4% ПФА для транскардиальной перфузии и получить аналогичные результаты. Оптимизируйте время и температуру инкубации. - Инкубируйте срезы в первичном растворе антител в течение ночи в режиме ЛТ с легким покачиванием. Используйте предварительно проверенное время и температуру инкубации.
- Промойте срезы 3 раза в PBS в течение 5 минут при RT с легким покачиванием.
- Приготовьте раствор биотинилированного вторичного антитела в соотношении 1:1000, разведенного в блокирующем растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное антитело должно быть поднято против вида-хозяина, используемого для создания первичного антитела. - Инкубируйте срезы во вторичном растворе антител в течение 1,5 ч при РТ. Осторожно покачивайте.
- Приготовьте раствор авидин-биотинпероксидазы (АВК) не менее чем за 60 минут до окончания инкубации вторичных антител.
- С помощью откалиброванной пипетки измерьте 8,80 мкл/мл растворов A и B и разбавьте их в PBS.
- Слегка покачивайте в течение не менее 60 минут при RT, чтобы обеспечить полное связывание между молекулами авидина и биотина.
- После инкубации во вторичном растворе антител промойте 3 раза в PBS в течение 10 минут на RT.
- Инкубируйте срезы в растворе ABC в течение 1 часа на RT. Осторожно покачивайте.
- Стирать один раз в PBS и два раза в TBS в течение 10 минут в RT с легким покачиванием.
- Приготовьте свежий раствор 0,05% 3,3'-диаминобензидина (DAB) с 0,005% H2O2, разведенный в TBS.
- Взвесьте 12,5 мг DAB и разведите его в 25 мл холодного TBS. Беречь от света.
ВНИМАНИЕ: Порошок DAB очень летуч и вреден при вдыхании. Он является канцерогенным и тератогенным. Таким образом, беременным или кормящим женщинам не стоит манипулировать этим продуктом, даже в разбавленном виде. Используйте маску N95 при работе и надевайте СИЗ. - Отфильтруйте раствор и добавьте 4,5 мкл 30% H2O2 непосредственно перед использованием.
- Взвесьте 12,5 мг DAB и разведите его в 25 мл холодного TBS. Беречь от света.
- Инкубируйте секции в растворе DAB в течение 3–7 минут на RT. Осторожно покачивайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коричневый осадок не должен быть слишком темным, чтобы избежать высокого уровня окрашивания фона. Время инкубации должно быть оптимизировано соответствующим образом. - Остановите реакцию быстрым промыванием дважды в холодном TBS, затем дважды по 10 мин в холодном TBS на RT, затем дважды по 10 мин в PB, с легким покачиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование PB (а не PBS) имеет решающее значение для устранения любых следов NaCl, так как он вступает в реакцию с осмием и образует кристаллы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Схемы основных этапов протокола. Мозг обезьяны (A) разрезается на последовательные секции с помощью охлаждающего вибратома (B). Затем он обрабатываетс...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dibasic безводный фосфат натрия | |||
| Моноосновной моногидрат фосфата натрия | |||
| Sodium chloride (NaCl) | |||
| HCl | |||
| NaOH | |||
| Paraformaldehyde< | |||
| Acrolein (90%) | |||
| Autopsy venting table | |||
| Needle (perfusion) | |||
| Игла | |||
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Acepromazine | |||
| Scalpel | |||
| Лезвия скальпеля< | |||
| Хирургические ножницы | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | |||
| Vibratome razor | |||
| Glycerol | |||
| Этиленгликоль | |||
| Sodium borohydride | |||
| Обычная лошадиная сыворотка | |||
| Холодный рыбный желатин | |||
| Первичное антитело, SERT | |||
| Первичное антитело, ChAT | |||
| Первичное антитело, TH | |||
| Биотинилированное вторичное антитело, коза | |||
| Biotinylated secondary body, mouse< | |||
| Vectastain elite ABC kit | |||
| 3'3 diaminobenzidine (DAB) | |||
| Peroxide 30% |
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение