$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.
- Tissue Staining
- В светонепроницаемой коробке для окрашивания создайте "камеру влажности" из безворсовых тканей, пропитанных деионизированной водой.
- Высушите края слайда салфеткой без ворса, используйте мини-ручку, чтобы сделать жидко-отталкивающую границу на самом краю слайда, вдали от участков ткани. Эта граница должна обеспечивать достаточное пространство между мениском жидкости и краем ткани, чтобы поверхностное натяжение не влияло на окрашивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Граница для отталкивания ручки Папаниколау может быть применена до 1.1.3, если интересующие антитела не требуют микроволнового извлечения антигена. Если пап-ручка была применена перед стиркой в PBS, на этом этапе необходимо проверить целостность жидкоотталкивающей границы. Используйте мини-ручку, чтобы заполнить любые пробелы в границе. - С помощью слайдов, расположенных горизонтально, блокируйте связывание неспецифических антигенов, инкубируя в 4% v/v сыворотке в PBS (блочный раствор). Пипетка 300 мкл блочного раствора на предметное стекло в течение 1 часа при комнатной температуре. Убедитесь, что блочный раствор распространяется на пап-ручку по краю предметного стекла и полностью покрывает ткань, чтобы избежать неравномерного окрашивания, вызванного поверхностным натяжением рядом с тканью.
- Используйте сыворотку того же вида, у которого вырабатывается вторичное антитело. Примечание: В этой процедуре у осла вырабатываются вторичные антитела, и поэтому используется сыворотка осла. Если используются вторичные антитела от двух или более разных видов, включите сыворотку от каждого вида.
- Пипетка первичного антитела на предметные стекла. Примечание: Концентрации антител для этого окрашивания были оптимизированы на уровне 1:5000 и 1:500 для Iba1 и Pan-нейронов соответственно. Было обнаружено, что эти концентрации демонстрируют значимое окрашивание без фонового окрашивания.
- Разбавьте блочный раствор до 1% сыворотки в PBS и добавьте первичные антитела. Пипеткой 300 мкл раствора первичного антитела в 1% сыворотке крови на предметное стекло. Опять же, убедитесь, что жидкость находится до края пап-ручки. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
- Включите три контрольных слайда: один, который не содержит ни Iba1, ни пан-нейрональных антител, один с Iba1 без пан-нейронального антитела, и один с пан-нейрональным антителом без Iba1. Окрашивайте эти предметные стекла в одном и том же прогоне теми же растворами, однако опускайте первичные антитела, чтобы проверить неспецифическое связывание вторичных антител.
- На следующее утро смывка слайдов три раза в PBS по 5 минут каждая, меняя раствор между стирками.
- Флуоресцентные антитела чувствительны к свету, поэтому, начиная с этого шага, минимизируйте воздействие света, убедившись, что контейнеры для мытья завернуты в фольгу, а коробки для гибридизации либо черные, либо инкубированы в темноте. Пипеткой нанесите соответствующие вторичные антитела на все предметные стекла и инкубируйте в течение 60 мин при комнатной температуре при концентрации 1:250 в блочном растворе (см. шаг 1.2.3) в светонепроницаемой «камере влажности» (см. шаг 1.2.1).
- Используйте вторичные антитела разной длины волны. В данном случае для первичного антитела кролика anti-Iba1 используйте donkey anti-rabbit 594 в качестве подходящего вторичного антитела. В качестве первичного антитела против паннейронов мыши используйте donkey anti-mouse 488 в качестве соответствующего вторичного антитела. В качестве альтернативы используйте анти-кролик 488 и анти-мышь 594.
- Wash слайды три раза в PBS по 5 минут каждый.
- Опционально: выполнить ядерное окрашивание.
- Поместите в Hoechst (или другое ядерное пятно) с концентрацией 0,03 мкг/мл в двойную дистилляцию H2O ровно на 60 секунд.
- Стирайте слайды три раза в PBS по 5 минут каждый.
- Wash in ddH2O.
- Coverslipping
- Coverslip слайды с водным монтажным материалом, таким как Fluoromount-G или ProlongGold. Позаботьтесь о том, чтобы удалить все пузырьки с помощью аппликатора с ватным наконечником.
Примечание: Можно использовать и другие монтажные агенты, однако некоторые отмечают высокую степень протекания между красителями в течение нескольких дней после снятия покрова. - Используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать края, предотвращая высыхание секций из-за испарения. Дайте лаку для ногтей высохнуть в светонепроницаемом контейнере, пока слайды остаются плоскими и при комнатной температуре, а затем храните в светонепроницаемом контейнере, завернутом в фольгу, при температуре 4 °C.