Иммуногистохимическое окрашивание биомаркеров в нейросферных срезах опухоли головного мозга

Аннотация

Источник: Núñez, F. J., et al. Оценка биомаркеров у глиомы с помощью иммуногистохимии на встроенных в парафин 3D-культурах нейросферы глиомы. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется иммуногистохимический метод мечения биомаркеров опухолей в нейросферах опухолей головного мозга, встроенных в парафин. Срезы нейросферы подвергаются удалению парафина и регидратации с последующей обработкой для выявления участков биомаркеров. Затем наносятся первичные и вторичные антитела для маркировки этих биомаркеров. Вторичные антитела связываются с авидин-конъюгированными ферментами пероксидазы, которые окисляют хромогенные субстраты для обозначения мест расположения биомаркеров. Наконец, ядерное противоокрашивание и подготовка предметного стекла для микроскопического анализа.

Протокол

1. Иммуногистохимия (ИГХ) парафин-залитых нейросфер (НС)

1. Расплавьте парафин, поместив предметные стекла в металлический стеллаж и инкубируя их при температуре 60 °C в течение 20 мин.
2. }}Депарафинизируйте предметные стекла путем инкубации в регидратационной системе при комнатной температуре (RT): 3x ксилол в течение 5 минут, 100% 2x этанол в течение 2 мин, 95% 2x этанол в течение 2 мин, 70% 1x этанол в течение 2 мин и 1x деионизированная вода в течение 2 мин. В этом случае держите предметные стекла в водопроводной воде до тех пор, пока не будет извлечен антиген, так как высыхание вызовет связывание неспецифических антител.
3. Предметные стекла инкубируют в цитратном буфере (10 мМ лимонной кислоты, 0,05% неионогенного детергента, pH 6) при 125 °C в течение 30 с и при 90 °C в течение 10 с. Дайте им остыть, затем промойте горки 5 раз дистиллированной водой.
4. Инкубируйте предметные стекла при RT в 0,3% H₂O₂ в течение 30 мин.
5. Промойте предметные стекла 3 раза в моющем буфере (0,025% моющего средства в Трис-буферном физрастворе [TBS]) в течение 5 минут с легким перемешиванием.
6. Инкубируйте предметные стекла в ОТ с блокирующим раствором (10% лошадиная сыворотка, 0,1% бычий сывороточный альбумин [БСА] в TBS) в течение 30 мин.
7. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере с первичным антителом, приготовленным в растворе разведения (0,1% BSA в TBS). Промойте предметные стекла 3 раза в моющем буфере в течение 5 минут с легким помешиванием.
8. Предметные стекла инкубируют в режиме ОТ в течение 1 ч с биотинилированным вторичным антителом, приготовленным в растворе разведения. Промойте предметные стекла 3 раза в моющем буфере в течение 5 минут с легким помешиванием.
9. Инкубировать предметные стекла в РТ в темноте в течение 30 минут с авидин-биотинилированным комплексом пероксидазы хрена. Промойте предметные стекла 3 раза в моющем буфере в течение 5 минут с легким помешиванием.
10. Инкубируйте предметные стекла с 3,3′-диаминобензидином (DAB)-H₂O₂ субстратом здесь в течение 2-5 минут на RT.
11. Промойте 3 раза водой из-под крана. Опустите (на 1-2 с) предметные стекла в раствор гематоксилина, чтобы скрыть их, затем тщательно промойте в водопроводной воде до прозрачности.
12. Обезвоживайте предметные стекла следующим образом: инкубировать в дистиллированной воде в течение 2 минут, погрузить 3 раза в 80% этанол, инкубировать в 95% этаноле 2 раза по 2 минуты, инкубировать в 100% этаноле 2 раза по 2 минуты и, наконец, в ксилоле 3 раза по 3 минуты.
13. Нанесите на предметные стекла монтажный носитель на основе ксилола и дайте им высохнуть на плоской поверхности в режиме RT, пока они не будут готовы к визуализации.

ПРИМЕЧАНИЕ: При окрашивании DAB, слайды можно хранить в RT. Однако, если проводится иммунофлуоресцентное окрашивание, предметные стекла следует хранить в темноте при температуре -20 °C, чтобы уменьшить фотообесцвечивание.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кролик поликлональный анти-ATRX,	Санта-Круз Биотехнология	sc-15408	IHC, 1::1 250 разведение
Кролик поликлональный анти-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 разведение
Кролик поликлональный анти-OLIG2	Миллипор	AB9610	IHC, 1:500 разведение
Козий поликлональный антикроличий биотин-конъюгированный	Dako	E0432	IHC, 1:}} 1000 разведения
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
НАБОР ДЛЯ ХРОМОГЕНА BETAZOID DAB{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/цена до 12/18	}