Ультраструктурный анализ среза мозга мыши с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Аннотация

Источник: Лутц, Д., et.al. Оценка параметров ультраструктурной нейропластичности после внутриутробной трансдукции развивающегося головного и спинного мозга мыши. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется подготовка и анализ участка мозга щенка мыши с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Протокол начинается с того, что фиксированная ткань с тетраоксидом осмия встраивается в смолу, за которой следует точная обрезка для изоляции исследуемой области и ультрамикротомия для получения полутонких и ультратонких срезов, которые визуализируются с помощью световой микроскопии и ПЭМ соответственно.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Выбор параметров ультраструктурной нейропластичности для количественного анализа

1. Картирование области интереса
   1. Выберите область интереса (например, гиппокамп или мозжечок) и локализуйте область в атласе разреза, выбрав изображение из атласа, содержащее эту область.
   2. Нарисуйте границы области интереса на изображении разреза и найдите/наложите эти границы области на образец смолы.
   3. Нанесите царапины на границы области интереса (например, гиппокампа или мозжечка) на образце смолы с помощью тонкой иглы (26 G, 1 дюйм).
   4. Нагрейте образец смолы до 85 °C в духовке, чтобы размягчить смолу для обрезки, или, в качестве альтернативы, используйте устройство для обрезки, тонкое лезвие или наждачную бумагу.
   5. Вырежьте интересующую область из образца смолы лезвием бритвы. Закрепите образец на держательных брусьях из акрилового стекла необходимого калибра (например, диаметром 8 мм и длиной 1 см) с помощью клея. Обрежьте установленный образец для полутонкого и ультратонкого среза.
   6. Подготовьте полутонкие (0,75 мкм) и ультратонкие (70 нм) участки обрезаемого участка с помощью ультрамикротома: установите его на 1,5 мм/с для толщины 0,75 мкм и на 0,7 мм/с для толщины 70 нм.
   7. Соберите полутонкие срезы на стеклянных носителях и окрасьте срезы 1% толуидиновым синим в PBS (на 4 мин).
   8. Промойте срезы несколько раз в деионизированной воде. Исследуйте окрашенные срезы под световым микроскопом с помощью объективов 4x (NA 0,1 ∞/-), 10x (NA 0,22 ∞/0,17), 40x (NA 0,65 ∞/0,17) и 100x (NA 1,25 ∞/0,17).
   9. Соберите ультратонкие секции на никелевых сетках. Подвергайте сети воздействию ПЭМ при напряжении 180 кВ и увеличении 3 200x, 6 000x и/или 8 000x.
2. ПЭМ-анализ
   1. Выберите ультраструктурные параметры, представляющие интерес для количественного анализа ПЭМ (например, бутоны с везикулами и митохондриями или миелинизированные и немиелинизированные аксоны) и сделайте ПЭМ-изображения этих параметров при увеличении 3500x, 6000x и/или 8000x.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.A. 22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives
Москитные гемостатические щипцы (12.5cm, изогнутые)<	13010-12	<
Тед Пелла	1GC200
Бритвенные лезвия<
Technovit 4004 два компонента glue	Kulzer
Тонкое устройство с вибрирующим лезвием бритвы	Krup	- style='width:427pt;'>with Szabo thin blades
Toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
Просвечивающий электронный микроскоп C20	Phillips	- style='width::427pt;'>до 200 кВ<
Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	смола для встраивания ткани
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219

<td style='height:15.75pt;width:189pt;'>Light microscope Basic DM Etd style='width:179pt;'>FSTtd style='height:15.75pt;width:189pt;'>Никелевые сетки, 200 мешtd style='width:179pt;'>Schick<td style='width:250pt;'>87-10489td style='height:15.75pt;width:189pt;'>Ultracut E