Просвечивающая электронно-микроскопическая визуализация эндоцитоза синаптических везикул в нейронах гиппокампа мыши

Аннотация

Источник: Villarreal, S., et. al., Измерение эндоцитоза синаптических везикул в культивируемых нейронах гиппокампа. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует анализ эндоцитоза синаптических везикул в культивируемых нейронах гиппокампа с помощью мечения пероксидазы хрена и электронной микроскопии.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

Электронная микроскопия

1. }Приготовьте раствор для стимуляции с высоким K⁺ с HRP (пероксидазой хрена) в виде 31,5 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 90 мМ KCl, 25 мМ HEPES (pH 7,4), 30 мМ глюкозы, 2 мМ MgCl₂, 0,01 мМ CNQX, 0,05 мМ AP5 и 5 мг/мл HRP, затем доведите до pH 7,4 с 5 М NaOH.
   1. Стимулируйте культуру нейронов гиппокампа с помощью 1,5 мл раствора для стимуляции K⁺ при комнатной температуре (называемого K⁺) путем добавления 1,5 мл в каждую лунку в течение 90 с. В состоянии покоя (обозначаемом как R) применяют ту же концентрацию 5 мг/мл HRP в течение 90 с, но с обычным физиологическим раствором. Для извлечения образца нанесите раствор для стимуляции с высоким содержанием K⁺, как и для образца K⁺, затем быстро промойте и замените обычным физиологическим раствором и инкубируйте в течение 10 минут.
2. }Фиксация и окрашивание
   
   1. Приготовьте 0,1 М Na какодилатный буфер с использованием 21,4 г/л Na какодилата при pH 7,4. Зафиксируйте клетки с 4% глутаральдегидом в буфере из какодилата 0,1 М Na не менее чем на 1 ч при комнатной температуре. Промыть три раза с 0,1 М Na какодилатным буфером в течение 7 мин каждый.
   2. Приготовьте раствор диаминобензидина (DAB), состоящий из 0,5 мг/мл DAB с 0,3% H₂O₂} в ddH₂O, и отфильтруйте с помощью фильтра 0,22 мкм. Нанесите 1,5 мл раствора DAB на 30 мин при 37 °C. Трижды промойте 0,1 М Na какодилатным буфером в течение 7 мин каждый.
      ВНИМАНИЕ: DAB является токсичным и подозрительным канцерогеном. Пожалуйста, используйте перчатки и лабораторные халаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка DAB происходит из-за его окисления H₂O₂, как катализируется HRP. Небольшое увеличение компонентов приводит к усилению сигнала в образце. Увеличение концентрации HRP ускоряет действие катализатора. Достаточно большие концентрации H₂O₂ вызывают изнурительные побочные реакции с HRP, подавляя эффект мечения³². В данной работе концентрации данной системы мечения были выбраны на основе имеющихся в настоящее время исследований.
   3. Инкубируйте нейроны с 1,5 мл 1% OsO₄ в 0,1 М Na какодилатном буфере в течение 1 ч при 4 °C в качестве постфиксации. Трижды промыть 1,5 мл 0,1 M Na какодилатного буфера в течение 7 мин каждый.
      ВНИМАНИЕ: Из-за токсичности и реакционной способности OsO₄, хранение образца на льду в химическом колпаке во многих случаях предпочтительнее, чем использование холодильника для инкубации.
   4. Приготовьте 0,1 М буфер из ацетата натрия с 13,61 г/л ацетата натрия и 11,43 мл/л ледяной уксусной кислоты при pH 5,0. Трижды промыть 1,5 мл 0,1 М ацетатного буфера при pH 5,0 в течение 7 мин каждый и инкубировать с 1,5 мл 1% уранилацетата в 0,1 М ацетатном буфере при pH 5,0 в течение 1 ч при 4 °C. Трижды промыть 1,5 мл 0,1 М ацетатного буфера в течение 7 мин.
      
3. Встраивание эпоксидной смолы
   
   1. }Обезвоживайте культуру нейронов с помощью однократных промываний 1,5 мл 50%, 70% и 90% этанола в течение 7 минут в каждом, а затем 3 промывки 1,5 мл 100% этанола в течение 7 минут каждое в вытяжном шкафу.
   2. Смешайте 485 мл/л бисфенол-А-(эпихлоргидрин) эпоксидной смолы, 160 мл/л додеценилянтарного ангидрида (DDSA), 340 мл/л метил-5-норборнена-2,3-дикарбонового ангидрида (NMA) и 15 мл/л 2,4,6-трис(диметиламинометил)фенола (DMP-30) для получения эпоксидной смолы. Тщательно перемешайте, затем храните под вакуумом, чтобы удалить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно удалять пузырьки воздуха в смоле, особенно те, которые меньше видимых невооруженным глазом, потому что они могут вызвать полости в смоле во время разрезания.
   3. Инфильтрируйте образец, заменив этанол на 50% эпоксидную смолу в этаноле в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере, затем 70% эпоксидную смолу в этаноле в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере.
   4. Замените раствор эпоксидной смолы на 100% эпоксидную смолу и инкубируйте в течение 10 минут при 50 °C. Проведите две замены свежей 100% эпоксидной смолы с инкубацией в течение 1 часа при 50 °C. Добавьте свежую 100% эпоксидную смолу и дайте застыть при 50 °C в течение ночи, а затем при 60 °C в течение более 36 часов для затвердевания.
4. Снимите каждый образец с многолуночной пластины с помощью ручной пилы ювелира. С помощью микроскопа с инвертированным светом выбирают интересующие области, плотные концентрации клеток, а затем вырезают блоки размером от 70 до 80 нм для разрезания по микротому. Установите область среза в патрон микротома и загрузите микротом. Расположите патрон в микротоме и установите алмазный нож ребром параллельно поверхности блока. Собирайте секции толщиной от 70 до 80 нм непосредственно на отдельные сетки.
5. Растворите уранилацетат в воде для получения 1% раствора по весу и отдельно растворите цитрат свинца в воде для получения 3% раствора по весу. Для улучшения контрастности образцов срезы погрузите в воду 1% водный уранилацетат на 15 минут, а затем 3% водный цитрат свинца на 5 минут.
6. ЭМ-визуализация
   1. Исследуйте срезы с помощью просвечивающего электронного микроскопа и записывайте изображения с помощью цифровой ПЗС-матрицы с первичным увеличением 10 000-20 000 раз.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	Среда роста для нейрона, прогрев до 37°C перед использованием
B27	Thermo Fisher	17504-044	Градиент для нейрональной дифференциации
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Градиент для нейрональной культуры
Trypsin XI из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Sigma	T1005	Нейрональная культура-переваривание тканей
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Sigma	D5025	Нейрональная культура-ингибирует суспензию
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	Электронная микроскопия, субстрат для роста нейронов, нанести на многолуночную пластину в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промыть стерилизованной водой 3 раза
Хрен-пероксидаза(HRP)<	P6782	Электронная микроскопия, мечение эндоцитозированных синаптических везикул путем катализа DAB в присутствии перекиси водорода, конечная концентрация 5 мг/мл в обычном физрастворе, сделать свежим перед использованием
Sodium cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300	Электронная микроскопия, буфер для фиксаторов и промывки, конечная концентрация 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB)	Sigma	D8001	Электронная микроскопия, маркировка эндоцитозированных синаптических везикул, субстрат для HRP, конечная концентрация 0,5 мг/мл в DDW и отфильтрованный, сделать свежим перед использованием
Водород раствор перекиси	Sigma	H1009	Электронная микроскопия, маркировка эндоцитозированных синаптических везикул путем индукции реакции HRP-DAB, конечная концентрация 0,3% в DDW, свежий перед использованием
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16365	Электронная микроскопия, фиксаторы, конечная концентрация 4% в буфере Na-какодилата, освежить перед использованием, хорошо встряхнуть перед использованием
TEM	JEOL	200CX	Электронная микроскопия, визуализация эндоцитозированных везикул и ультраструктурных изменений
CCD digital camera	AMT	XR-100	Электронная микроскопия, захват изображений
Цитрат свинца	Leica microsystems	16707235	Электронная микроскопия, окрашивание сеткой

гиппокампа вязких клетокtd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:111pt;'>Sigma