Биолюминесцентная визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей

Аннотация

Источник: Breid, S., et. al. Биолюминесцентная визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей после периферической инокуляции фибрилл альфа-синуклеина. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует биолюминесцентную визуализацию нейровоспаления у трансгенных мышей, демонстрируя люцифераз-люцифериновые реакции в активированных астроцитах. Протокол позволяет проводить неинвазивную количественную оценку активации астроцитов, помогая исследованиям воспаления ЦНС и терапевтической эффективности.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

Животная модель

1. }Скрещивание полузизиготных мышей Tg(Gfap-luc+/-) с гемизиготными мышами Tg(M83+/-) для создания гемизиготных больших мышей Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-).
2. Генотипирование потомства с помощью ПЦР в реальном времени на наличие трансгена, кодирующего альфа-синуклеин человека, и стандартной ПЦР на люциферазу светлячков.
3. Прививайте животных в возрасте от шести до восьми недель.

Препарат инокулюма

1. }Получить мономерный рекомбинантный человеческий альфа-синуклеин с мутацией A53T в трис-буферном физрастворе (TBS), содержащем 150 мМ NaCl в 20 мМ Tris-HCl (pH 7,2).
2. Подготовьте фибриллярный альфа-синуклеин для посевов путем перемешивания 3 мкг/мл мономерного рекомбинантного альфа-синуклеина человека в орбитальном шейкере при 800 об/мин и 37 °C в течение 5 дней.
3. Разбавьте фибрильные сборки в фосфатно-солевом буфере (PBS) до достижения конечной концентрации 1 мкг/мкл для внутрибрюшинных посевов.
4. Фрагментировать фибриллы альфа-синуклеина палочковым ультразвуковиком в течение 1 мин (40 импульсов длительностью 0,5 с с паузой в одну секунду между каждым импульсом и амплитудой 50%) на льду. Во избежание загрязнения при перекрестном посеве. Используйте чистые ультразвуковые щупы для приготовления различных инокулятов.

Внутрибрюшинные инъекции

1. При внутрибрюшинных инъекциях животным следует кратковременно ввести наркотики в анестезиологической камере путем ингаляции изофлураном/кислородом со скоростью потока 2 л/мин и установкой испарителя на 2%. Ущипните палец ноги животного и подтвердите, что оно не отводит заднюю конечность, чтобы обеспечить надлежащую анестезию.
2. Наполните одноразовый шприц для подкожных инъекций массой 27 г 50 мкл ультразвукированных альфа-синуклеиновых фибрилл или PBS.
3. Вводите препарат непосредственно в брюшину мыши и избегайте проникновения в тонкую кишку или слепую кишку, расположенную за брюшной стенкой, удерживая животное в дорсальном положении головой в сторону от исследователя и вниз под углом примерно 45°. Наблюдайте за животными до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.

Биолюминесцентная визуализация

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) мыши каждые 2-4 недели с использованием системы биолюминесцентной визуализации.
2. Перед визуализацией мышей проводят кратковременную анестезию в изофлуран/кислородной камере с расходом 2 л/мин и вапорайзером, установленным на 2%. Ущипните палец ноги животного и подтвердите, что оно не отводит заднюю конечность, чтобы обеспечить надлежащую анестезию.
3. Побрейте и депилируйте головы мышей с помощью крема для депиляции. Покрасьте уши в черный цвет с помощью нераздражающего маркера, чтобы блокировать неспецифическую биолюминесценцию.
4. Разведите D-люцифериновую калийную соль, субстрат люциферазы, в PBS до исходного раствора 30 мг/мл. Храните его в 1 мл аликвот при температуре -20 °C. Защищайте растворенный D-люциферин от воздействия света.
5. Взвесьте животных перед инъекцией. Рассчитайте точный объем D-люциферина для инъекций 150 мг/кг массы тела. Внутрибрюшинно ввести D-люциферин и вернуть животное в наркозную камеру.
6. Запустите программное обеспечение для работы с изображениями. После того, как система визуализации достигнет своей рабочей температуры, инициализируйте систему, нажав на кнопку «Инициализировать» на панели управления.
7. Выберите кнопки «Люминесцентный» и «Фотография». Установите время экспозиции на 60 с, биннинг на 'Medium', F/Stop на '1', а усиление EM на 'Off'.
8. Убедитесь, что фильтр возбуждения установлен в положение «Блокировать», а фильтр излучения — в положение «Открыто», и установите высоту объекта на 1,50 см.
9. Через десять минут после инъекции D-люциферина поместите животных на нагревательную пластину в камере визуализации и убедитесь, что их морды правильно расположены в выходе для анестезии. Закройте поток изофлурана/кислорода из ингаляционной камеры и откройте поток для камеры визуализации со скоростью потока 0,25 л/мин и испарением 2%. Плотно закройте дверцу камеры визуализации.
10. Нажмите на кнопку "Получить", чтобы измерить биолюминесценцию, которая занимает 60 с.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
27-gauge syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-люциферин калийная соль	Acris	LK10000	30 мг/мл стокового раствора
Thermomixer	Eppendorf	5776671	<
Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer		<
PerkinElmer
Tg(M83+/-) мыши или B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J мыши	Лаборатория Джексона	4479

td style='height:14.5pt;width:211pt;'>Ультразвуковой аппарат Sonopuls Mini20td style='height:14.5pt;width:211pt;'>Living Image 3.0 Software