Это видео демонстрирует метод ретроградного мечения моторных нейронов Drosophila с использованием липофильных красителей. Краситель проникает в аксон, перемещается в обратном направлении и помечает нейроны зеленым цветом, позволяя детально визуализировать их морфологию и проекции под конфокальным микроскопом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ретроградное мечение моторных нейронов дрозофилы с помощью флуоресцентных липофильных красителей
869 просмотров
⸱
28 апреля 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
1. Оборудование и расходные материалы
- Материалы для сбора эмбрионов и обучения взрослых особей откладыванию яиц
- Подготовьте фильтрационный аппарат, разрезав пробирку объемом 50 мл и прорезав отверстие в колпачке для установки сетчатого фильтра с порами 100 мкм (Таблица материалов) между пробиркой и Колпачок.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, клеточные сетчатые фильтры с порами 100 мкм (Таблица материалов) могут быть использованы для стадии фильтрации при сборе эмбрионов. - Приготовьте агаровые пластины с премиксом виноградного агара (Таблица материалов) в соответствии с приведенными инструкциями. На короткое время осторожно размешайте один пакетик порошковой смеси в 500 мл дистиллированной воды комнатной температуры (RT, 23 °C) (dH2O) и разогрейте растворенную смесь в микроволновой печи до мощного кипения. После охлаждения до 70−75 °C перелейте смесь в чашки Петри (60 мм). После того как агар застынет, храните пластины при температуре 4 °C.
- Приготовьте дрожжевую пасту, смешав активные сухие дрожжи (Таблица материалов) и воду до консистенции пасты, и держите при температуре 4 °C.
- Используйте клетки для сбора яиц (для чашки Петри 60 мм, Таблица материалов), которые обеспечивают достаточный поток воздуха.
- Подготовьте фильтрационный аппарат, разрезав пробирку объемом 50 мл и прорезав отверстие в колпачке для установки сетчатого фильтра с порами 100 мкм (Таблица материалов) между пробиркой и Колпачок.
- Подготовка игл для рассечения и микропипеток для инъекций красителя
- }Подготовьте микропипетку для инъекции красителя и иглу для рассечения из той же капиллярной трубки с внутренним диаметром 0,6 мм и внешним диаметром 1,2 мм (Таблица материалов). Потяните капиллярную трубку с помощью съемника микропипетки при напряжении 7% от максимальной выходной нагрузки 170 В (Таблица материалов), чтобы получить острую иглу с конусностью ~0,4 см в длину.
- Для введения красителя отрегулируйте микропипетку со скошенной микропипеткой (Table of Materials) с помощью техники снятия фаски с пузырьками, описанной в руководстве по эксплуатации прибора.
- Короче говоря, смочите кофемолку смачивающим агентом (Таблица материалов), чтобы вода не «тянула» кончик иглы. Поместите иглу на зажим для микропипетки под углом 25−30° и опустите кончик на две трети радиуса от центра поверхности снятия фаски. Шлифуйте иглу, пока шприц с трубкой проталкивает воздух внутрь иглы, чтобы в микропипетке не было стеклянной стружки.
- Отметьте микропипетку перманентным маркером с тонким наконечником, чтобы указать положение отверстия на кончике после снятия фаски, так как найти узкое отверстие микропипетки, сформированное под углом, сложно.
2. Подготовка к сбору эмбрионов
- Убедитесь, что взрослые мухи (20−40 диких типов Canton-S или белые), самцы и самки, содержатся в молодых (<7 дней) и здоровых условиях для идеального сбора яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стимулировать откладывание яиц, мух тренируют в клетке для сбора яиц за пару дней до сбора яиц на агаровых пластинах, покрытых дрожжевой пастой, по крайней мере, один раз в день.
3. Стадирование эмбриона
- }Дайте мухам отложить яйца в течение ночи (или не менее 15 часов) в RT, чтобы собрать эмбрионы через 15 часов после откладки яиц (AEL), т.е. на стадии 16, чтобы увидеть дендритогенез моторных нейронов передней угловой клетки (aCC) и сырой креветки 3 (RP3). Утром соберите тарелку с яйцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы через 15 ч AEL будут иметь отчетливый 4-камерный кишечник. Для визуализации различных стадий учитывают их специфические морфологические критерии и условия старения. - Чтобы собрать эмбрионы, дехорионате яйца, уложенные на тарелке, 50% отбеливателем в течение 5 минут.
- Как только хорионы очистятся, вылейте содержимое пластины через фильтрующий аппарат или клеточное ситечко, чтобы изолировать эмбрионы. С помощью отжимной бутылки с водой разбавьте оставшийся на тарелке отбеливатель и соберите как можно больше эмбрионов, сцедив смесь в фильтр.
- Промойте зародыши на фильтре 3−4 раза большим количеством воды или до тех пор, пока запах отбеливателя не рассеется. Снимите фильтр с аппарата и промойте зародыши на другой чистой пластине с водой. Сцедите воду из новой тарелки, на которой находятся эмбрионы.
- Подготовьте предметное стекло, накрыв его двумя слоями виниловой ленты в центре, сформировав прямоугольник. Вырежьте из ленты прямоугольную лужу с помощью лезвия бритвы. Поместите тонкую полоску двустороннего скотча ближе к верхнему концу бассейна, именно туда будут помещены эмбрионы, как показано на рисунке Рисунок 1.
- С помощью тонких щипцов индивидуально отобрать 5−10 эмбрионов в 15 ч AEL и поместить их на двусторонний скотч тыльной стороной вверх. Добавьте физиологический раствор Рингера от насекомых в бассейн для вскрытия, чтобы защитить эмбрионы от высыхания (Рисунок 1).
4. Вскрытие и окрашивание
- С помощью стеклянной иглы под препарирующим микроскопом (Таблица материалов) прорежьте среднюю линию одного эмбриона на его поверхности от заднего до переднего конца. Затем вытащите эмбрион из вителлиновой мембраны с ленты на стекло (в рамке Рисунок 1). Следите за тем, чтобы не повредить внутренние ткани эмбриона.
- Переверните эпителиальные ткани от центра и прикрепите край эпидермиса к поверхности предметного стекла (Рисунок 1, вставка).
- С помощью иглы, соединенной с трубкой, с отверстием кончика ~300 мкм (полученной путем ломания тонкого кончика иглы для вскрытия), аспирируйте или выдувайте воздух, чтобы отделить и удалить дорсальные продольные стволы трахеи, а также любые оставшиеся кишки.
- Используйте 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS) для фиксации эмбрионов в течение 5 минут в режиме RT. Промойте эмбрионы 3 раза PBS. Промойте эмбрионы 3 раза PBS.
- Окрашивать эмбрионы 1 мкл антитела против пероксидазы хрена, конъюгированного с красителем цианина 3 (анти-HRP Cy3) (Таблица материалов) в 200 мкл PBS в течение 1 ч. Промойте эмбрионы PBS 3x после окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель анти-HRP может быть изменен в зависимости от липофильных красителей, выбранных для инъекций.
5. Наполнение микропипетки для инъекций
- Нагреть липофильные красители (5 мг/мл 3,3'-диоктадецилоксакарбоцианина, перхлората (DiO) или 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианина, 4-хлорбензолсульфоната соли (DiD), Таблица материалов) до 60 °C в смеси этанола 1:10: растительное масло перед применением.
- Приготовьте предметное стекло с растворенным в масле красителем для инъекционной микропипетки. Поместите микропипетку в держатель капилляров (Рисунок 2, #1). С помощью микроманипулятора (Таблица материалов) отрегулируйте микропипетку так, чтобы она находилась над предметным стеклом красителя. Затем отрегулируйте предметный столик так, чтобы поместить микропипетку на краситель (Рисунок 2, #2).
- Чтобы наполнить микропипетку, используйте микроинъектор (Таблица материалов) (Рисунок 2, #3). Соберите краситель в микропипетку, установив Pi (давление инъекции) в диапазоне 200−500 гПа (гектопаскаль), Ti (время инъекции) в диапазоне 0,1−0,5 с и Pc (компенсационное давление) на 0 гПа в течение 5 мин (Рисунок 2, #4).
- После того, как краситель будет собран, снимите предметное стекло и поместите образец на предметный столик микроскопа. Затем увеличьте Pc до диапазона 20−60 гПа перед опусканием микропипетки в образец, чтобы предотвратить загрязнение PBS капиллярным действием.
6. Введите краситель в нейроны
- Найдите эмбрион в центре с помощью микроскопа с 10-кратным объективом (Таблица материалов) и совместите микропипетку с эмбрионом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер капли красителя можно регулировать, изменяя Pi или размер отверстия наконечника микропипетки. Размер капли должен составлять 10−20 мкм, что составляет примерно ширину 1 мышцы. - Замените линзу объектива на 40-кратную линзу с водяным погружением (Table of Materials) и погрузите линзу в PBS, чтобы увидеть эмбрион.
- С помощью флуоресцентной микроскопии проверьте морфологию нейронов, отмеченных анти-HRP Cy3, и определите место инъекции.
- Во время инъекции используйте светлопольную микроскопию, чтобы увидеть каплю красителя. Когда эмбрион находится в фокусе, измените положение микропипетки, чтобы обеспечить мягкий контакт с кончиком интересующего аксона (например, aCC, RP3).
- Капните краситель в правый брюшной (A2−A6) полусегмент в нервно-мышечном соединении aCC или RP3 (Рисунок 3) с помощью DiD или DiO, используя нейроны, помеченные анти-HRP Cy3. С помощью ручного управления (мышь; Рисунок 2, 5) Отпустите краситель и удалите микропипетку, капнув краситель с помощью микроманипулятора, и перейдите к следующему месту инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других красителей (например, Люциферовый желтый, кальцеин), которые распространяются в соседние клетки через щелевые соединения, липофильные красители связываются с клеточными мембранами и не передаются соседям. Однако из-за относительно большого размера капли красителя этот метод также приводит к мечению мышц-партнеров (Рисунок 3A).
- Перед визуализацией образец инкубируйте при RT в течение 1 ч после капли красителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь перед установкой, и образец может храниться при температуре 4 °C в течение ночи. Липофильные красители также могут быть доставлены с помощью ионофореза, если внутриклеточный усилитель с прямой связью (DC) легко доступен.
7. Визуализация с помощью конфокального микроскопа
- Снимите двусторонний скотч и виниловую ленту со стекла с помощью щипцов.
- Подготовьте защитный лист (22 x 22 мм2 защитное стекло No1) с небольшим количеством вакуумной смазки (Таблица материалов) по четырем углам и аккуратно положите на образец, не допуская образования пузырьков воздуха. Удалите излишки PBS с помощью очистителей задач.
- Нажмите на покровную крышку, чтобы отрегулировать рабочее расстояние между линзой объектива и образцом. Полностью заклейте края покровного стекла лаком для ногтей.
- Изображение с 10-кратным и 100-кратным увеличением с помощью конфокального микроскопа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Настройка бассейна для препарирования. Синяя камера, которую можно увидеть на предметном стекле, создана с помощью виниловой ленты, удерживающей буферы внутри. Двусторонняя лента удерживает эмбрионы, которые правиль...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10x объектив объектива | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor< | Конфокальный блок | |
| Cover glass | Corning | < | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | < |
| ThermoFisher | V22888 | < | |
| ThermoFisher | V22887 | ||
| Disputing microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Двусторонняя лента | Scotch | 665 | |
| Высоковакуумная смазка Dow corning | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Щипцы | Инструменты для изобразительной науки | 11252-20 | < |
| FlyStuff | 59-100< | ||
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | < |
| Sutter | BV-10-B | < | |
| Narishige | PC-100 | ||
| пакеты с порошком виноградного агара Nutri-fly | FlyStuff | 47-102-102 | < |
| Millipore | < | ||
| Электронная микроскопия науки | 15710 | Any EM grades | |
| PBS | Roche | 11666789001 | Продается на sigmaaldrich, коробочное решение 10x |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Смачивающий агент |
| Вертикальный флуоресцентный микроскоп | Nikon< | ||
| Виниловая изолента | Scotch | 6143 | < |
| VWR | 10199-659 | < | |
| FlyStuff | 62-103 | Активные сухие дрожжи (КРАСНАЯ ЗВЕЗДА) |
Теги
