Иммунофлуоресцентная микроскопия нервных клеток, дифференцированных из клеток периферической крови

Аннотация

Источник: Becker-Kojić, Z. A., et. al., генерация нейронных клеток, полученных из крови, без ГМ. J. Vis. Exp. (2021)

В видео демонстрируется протокол подготовки нервных клеток, полученных из перепрограммированных клеток периферической крови, для флуоресцентной микроскопии, демонстрируя различные типы клеток и стадии развития с помощью иммунофлуоресцентной визуализации.

Протокол

1. Иммунофлуоресцентная микроскопия нейронных клеток крови
   1. Культивируйте клетки в течение 16 дней и удаляйте среду.
      1. Инкубировать с предварительно подогретым фиксатором, состоящим из 75 мл стерильной воды, 4 г параформальдегида. Добавьте 10 Н NaOH по мере необходимости и перемешайте, пока раствор не исчезнет. Затем добавьте 10 мл 10x PBS, 0,5 мл MgCl₂, 2 мл 0,5 M EGTA и 4 г сахарозы. Титруйте до pH 7,4 с 6 N HCl и доведите до 100 мл стерильной воды в течение 15 минут.
      2. Выбросьте фиксатор и промойте клетки 3 раза в течение 5 минут каждый раз. Сразу же добавьте свежеприготовленный 0,3% раствор Triton X и пропитайте клетки в течение 5 минут. Промойте 3 раза PBS и добавьте блокирующий раствор PBS и 5% BSA.
      3. Заблокируйте ячейки при комнатной температуре на кулисной пластине на 1 час.
      4. Приготовьте соответствующие разведения антител в 1% BSA/PBS и инкубируйте клетки с разведениями антител на коромысле в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Промыть клетки 3 раза PBS по 5 мин каждая, инкубировать клетки с DAPI и смонтировать покровные стекла с монтажными средами для визуализации на микроскопе.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела с прямой меткой, используемые в этом эксперименте, перечислены в Таблица материалов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4	<
BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037 <
Fisher Scientific	10507591
Нейробазальный средний	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-орнитин	Sigma-Aldrich	P4957-50ML

td style='height:14.5pt;width:145pt;'>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488td style='height:14.5pt;'>Multiplatte Nunclon 4 wells