Анализ амилоидных структур в срезе ткани с помощью флуоресцентной пожизненной микроскопии

Аннотация

Источник: Nyström, S., et al., Визуализация амилоидных тканей, окрашенных люминесцентными конъюгированными олиготиофенами, с помощью гиперспектральной конфокальной микроскопии и флуоресцентной визуализации времени жизни. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео демонстрируется анализ амилоидных структур с помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией жизни или FLIM с использованием красителя hFTAA для выявления компактных ядер в виде синего/зеленого цвета, а нестабильных периферий в виде красного/желтого цвета на изображениях с цветовой кодировкой, что отражает организацию амилоида.

Протокол

1. Подготовка образцов тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Многие типы тканей могут быть визуализированы с использованием гептамер-формилтиофенуксусной кислоты (hFTAA) в качестве амилоидного маркера. hFTAA чувствительна к конформации агрегатов. Поэтому окрашивание предпочтительно проводить на неразрушенных агрегатах без воздействия эпитопов. Оптимальное спектральное качество достигается в том случае, если фиксация тканей сведена к минимуму. Следовательно, предпочтение отдается свежезамороженному материалу, аккуратно закрепленному в этаноле во время окрашивания. Тем не менее, можно обнаружить отложения амилоида также в тканях, которые были зафиксированы с помощью , например, , формалина. hFTAA в целом хорошо проникает в ткани. Выберите толщину образца, совместимую с предполагаемым методом визуализации.

1. Если используются фиксированные формалином и залитые парафином срезы, их следует депарафинизировать в ксилоле на ночь. Затем окуните секции в последовательные ванны с 99% этанолом, 70% этанолом, dH₂O и фосфатно-солевым буфером (PBS), по 10 минут в каждой. Дайте срезам ткани высохнуть в условиях окружающей среды.
   Внимание: Ксилол всегда обрабатывается в вытяжном шкафу для химических веществ. Ксилол и другие органические растворители вредны.
   1. Разморозьте криосекции при комнатной температуре. Зафиксируйте участки ткани в 10% формалине на ночь и увлажните их, погрузив в последовательные ванны с 99% этанолом, 70% этанолом, dH₂O и PBS, по 10 минут в каждой. Дайте срезам ткани высохнуть в условиях окружающей среды.
2. Добавьте капли рабочего раствора hFTAA (примерно 200 мкл) в срезы ткани, чтобы покрыть ее. Капля должна оставаться на месте за счет поверхностного натяжения. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре для окрашивания.
3. Смойте с помощью пипетки раствор для окрашивания 500 μL PBS, а затем погрузите предметное стекло в ванну PBS на 10 минут. Дайте секции высохнуть в условиях окружающей среды.
4. Монтаж осуществляется с помощью флуоресцентной монтажной среды. Дайте монтажной среде осесть на ночь.

2. FLIM
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальный микроскоп оснащен установкой флуоресцентной визуализации времени жизни (FLIM).

1. Установите следующие параметры для конфокального микроскопа: Pinhole, 20; длина волны возбуждения, 490 нм; интенсивность лазера, 0,5% (соответствует средней мощности 7,5 мкВт). Используйте импульсные лазеры на частоте 40 МГц.

2. В программном обеспечении FLIM настройте подсчет фотонов на длине волны более 550 нм. В окне Параметры отображения следите за подсчетом фотонов до тех пор, пока Максимальное количество фотонов не составит около 4 000 фотонов.

3. Сохраните файл и экспортируйте его как изображение с однофотонным подсчетом (SPC).

4. Подгонка данных под 2-компонентный экспоненциальный спад в программном обеспечении FLIM. Подгонка, которая дает χ² < 2, хороша. Значение по оси y — это количество отсчетов за заданное время жизни.

5. Выберите пороговое значение для включения счетчиков, e.com., 100. Цветовая маркировка по T1 и выбор диапазона времени службы. Распад зависит от структуры амилоида, с которой связывается hFTAA. Наблюдалось время жизни флуоресценции от 300 до 1000 пс. Сохраните файл.

6. Экспортируйте необработанные данные с помощью опций экспорта и сохраните нужные данные в новой папке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech	<
Dako Флуоресцена монтажная среда	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica		<
Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging		<
ASI spectral imaging	<
LSM780	Zeiss		<
Zeiss		<
Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Tunable Laser In Tune	Zeiss

td style='width:138pt;'> td style='height:14.5pt;width:285pt;'>Lumen 200td style='height:14.5pt;width:285pt;'>Spectraview softwaretd style='width:138pt;'> td style='height:14.5pt;width:285pt;'>Zen 2010b v6.0 softwaretd style='height:14.5pt;width:285pt;'>FLIM system