$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1.Live Запись изображений
1. Культивирование клеток нейронов WT и CCR5-/- гипоталамуса, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, меченный транспортером глюкозы 4 (GFP-GLUT4) на стеклянном покровном листе #1,5 (или толщиной 0,17 мм), который был предварительно покрыт поли-D-лизином в 6-луночном планшете.
2. Аккуратно снимите покровные стекла с нейронами с помощью щипцов и с осторожностью поместите их на стеклянные предметные стекла.
3. Удалите излишки среды/жидкости с помощью деликатных салфеток. Сложите салфетки в два раза, и аккуратно положите их поверх покровного стекла. Аккуратно прижмите салфетки, не перемещая покровную крышку.
ВНИМАНИЕ: Не прижимайте покровное стекло к предметному стеклу с силой. Цель этого шага — гарантировать, что защитное стекло не будет перемещаться/дрейфовать во время получения изображения, вызванного выталкивающей силой.
4. Поместите покровные стекла и предметные стекла на предметный столик деконволюционного микроскопа лицевой стороной вниз и надежно закрепите. Этот шаг необходим для того, чтобы положение слайда оставалось постоянным, чтобы пользователи могли отслеживать тот же набор целевых ячеек в дальнейшем.
5. Наблюдайте за клетками нейронов WT и CCR5-/- гипоталамуса с помощью линзы масляного иммерсионного объектива 60x/1,42 NA.
6. Обработайте отобранные образцы клеток CCL5 (10 нг/мл) или инсулином (10 ЕД/мл) в течение одной мин. Добавьте 1,5 мкл разведенного инсулина на край покровного стекла.
7. Визуализируйте и записывайте выбранные образцы клеток немедленно. Запрограммируйте программное обеспечение для записи видео на запись в течение 30 мин.
2. }Деконволюционная микроскопия и анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола требует использования деконволюционного микроскопа и специализированного программного обеспечения для анализа.
1. Включите питание системы визуализации, дайте инициализации предметного столика микроскопа должным образом, а затем включите светодиодный источник света.
2. Добавьте иммерсионное масло (показатель преломления 1,520 для живых образцов при 37 °C) на объектив объектива 60x 1,42 NA. Поместите предметное стекло на микроскоп покровным стеклом по направлению к линзе объектива и надежно закрепите предметное стекло.
3. Используйте светлопольное или флуоресцентное освещение для идентификации целевых клеток. Регулируйте фокус до тех пор, пока целевые клетки не станут отчетливо видны. Не перемещайте линзу объектива за пределы защитного стекла, чтобы избежать ненужных царапин.
4. Идентификация зеленого флуоресцентного белка, конъюгированного с транспортером глюкозы 4 (GFP-GLUT4) по сигналу GFP. Определение нужных целевых клеток для получения изображений. Выбранное положение целевой ячейки может быть запомнено для дальнейшего использования (см. Рисунок 1).
5. Установите надлежащие экспериментальные параметры (включая количество пикселей, длину волны возбуждения, процент пропускания, время экспозиции, толщину стека, временной интервал и общее время визуализации) для каждой целевой клетки. Для этого эксперимента количество пикселей изображения было установлено на 512 x 512 (для более высокого разрешения его можно установить на 1 024 x 1 024) для сигналов GFP. Время экспозиции было установлено в диапазоне от 0,025 до 0,05 с каждые 5 минут. Незначительные боковые корректировки x, y и z можно контролировать с помощью рекомендуемого программного обеспечения (см. Таблица материалов).
6. Установите параметр экспозиции примерно на 2 000–3 000 отсчетов, чтобы достичь максимальной интенсивности пикселей. Чтобы свести к минимуму флуоресцентное фотообесцвечивание, максимально уменьшите процент возбуждения светопропускания, сохраняя при этом время экспозиции менее 1 с. Повторите эти шаги для каждого дополнительного флуоресцентного канала (каналов) и каждой отдельной области интереса.
7. Установите верхний и нижний предел Z-стека на каждой целевой ячейке. Этого можно достичь, перемещая предметный столик микроскопа до тех пор, пока верхняя и нижняя части целевой клетки не окажутся немного не в фокусе. Пользователи могут регулировать разрешение по оси Z, устанавливая количество изображений между верхним и нижним пределом (что можно сделать, установив расстояние между каждым изображением).
8. Стопки изображений были деконволютированы и позже проанализированы с помощью соответствующего программного обеспечения – в данном случае Velocity от PerkinElmer.
