Микроскопический анализ синапсов в срезах гиппокампа мыши с использованием иммунофлюоресценции

Аннотация

Источник: McLeod, F., et al. Оценка плотности синапсов в срезах мозга грызунов гиппокампа. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео демонстрируется метод визуализации синаптических маркеров в срезах мозга гиппокампа с помощью конфокального иммунофлуоресцентного анализа. Срезы окрашивают первичными антителами, нацеленными на пресинаптические и постсинаптические маркеры, за которыми следуют флуорофор-конъюгированные вторичные антитела. Затем помеченные маркеры визуализируются с помощью конфокальной микроскопии для оценки синаптической архитектуры через их колокализацию.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.

1. Acute Hippocampal Slice Preparation

1. Удалите мозг мыши как можно быстрее, используя шпатель и острые ножницы, чтобы разрезать череп, и поместите его в ледяную, насыщенную кислородом (95% O₂, 5% CO₂) искусственную спинномозговую жидкость с высоким содержанием сахарозы (ACSF, ~ 100 мл).
2. Поместите мозг мыши на чашку Петри и удалите мозжечок и небольшой участок лобной коры с помощью скальпеля, прежде чем сбросить вниз по средней линии мозга.
3. Поместите два полушария на сторону, которая только что была вырезана, и приклейте каждое полушарие на сцену вибратома.
4. Отрежьте участки толщиной 200 - 300 мкм всей области интереса. В случае с гиппокампом следует получить примерно 3 – 4 среза на каждое полушарие.
5. Используя пластиковую пипетку Пастера, перенесите ломтики в камеру, погруженную в насыщенный кислородом (95% O₂, 5% CO₂) ACSF. Выдерживать при температуре 34 °C в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе срезы могут быть обработаны активными фармакологическими агентами, такими как рекомбинантные белки Dickkopf-1 (Dkk1), путем добавления агентов в камеру для срезов.
6. С помощью кисти удалите срезы из камеры, поместите их в 24-луночную пластину и зафиксируйте их на срок от 20 минут до 1 часа в 4% параформальдегиде (PFA)/4% сахарозе при комнатной температуре (RT).
   Внимание: PFA токсичен, носите соответствующую защиту.
7. Промойте ломтики три раза в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS, 10 мин каждый).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь на 1-2 дня, при условии, что срезы хранятся при температуре 4 °C в 1X PBS.

2. Иммунофлуоресценция для синаптических маркеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты всех используемых буферов можно найти в таблице 1.

1. В лунках для среза замените PBS на блокирующий/проникающий буфер (Таблица 1) и инкубируйте при RT в течение 4 - 6 часов.
2. Разбавьте поликлональное антитело морской свинки против везикулярного глутаматного транспортера 1 (vGlut1) в соотношении 1:2,000 в буфере для блокирования/пермеабилизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: vGlut1 - это маркер для пресинаптической возбуждающей терминальной визуализации. Для идентификации постсинаптического возбуждающего синапса используйте поликлональное антитело против постсинаптической плотности-95 (PSD-95) и разведите 1:500 в том же растворе. Используйте минимальный объем 300 мкл в каждой лунке. Чтобы определить анатомическое расположение гиппокампа, используйте антитело, которое также может идентифицировать нейронную структуру, например, ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2) или тубулин. Определите правильные концентрации всех первичных антител для синаптических маркеров выбора (пре- и постсинаптических) и разведите их в свежем блокирующем/пермеабилизирующем буфере.
3. Инкубируйте срезы в первичном растворе антител в течение ночи (или в течение 1-2 дней) при температуре 4 °C. Используйте платформу для встряхивания энергичными движениями.
4. Промойте ломтики три раза в PBS (по 10 минут каждый).
5. Разбавьте соответствующие вторичные антитела 1:500 в блокирующем буфере. Например, при использовании антитела к морской свинке vGlut1 применяют вторичное антитело, которое распознает компонент морской свинки (например, ослиную свинку против морской свинки), конъюгированный со специфическим флуорофором. При использовании антитела к кролику PSD-95 применяйте вторичное антитело, которое распознает компонент кролика (например, ослиный антикролик), конъюгированный с другим специфическим флуорофором.
6. Инкубируйте срезы в этом растворе в течение 2-3 часов на RT. Убедитесь, что срезы защищены от света, так как вторичные антитела чувствительны к свету.
7. Промойте ломтики три раза в PBS (по 10 минут каждый).
8. Осторожно удалите срезы с 24-луночной пластины с помощью кисти и равномерно разместите их на предварительно помеченных стеклянных предметных стеклах. Добавьте каплю монтажного средства поверх каждого ломтика, а затем аккуратно положите стеклянный покровный стекло поверх ломтиков. Не допускайте образования пузырьков воздуха. Следите за тем, чтобы использовать достаточное количество монтажной среды (300-400 μл), так как недостаточное количество может привести к высыханию ломтиков.
9. Оставьте сохнуть минимум на 1-2 дня в RT и держите слайды защищенными от света.
10. Храните слайды при температуре 4 °C в краткосрочной перспективе, но для долгосрочного хранения храните их при температуре -20 °C.

3. Получение и анализ

1. конфокальных изображенийВизуализация с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
   1. Определите область гиппокампа, которую нужно изобразить (например, роговые аммониас 1 и 3 (CA1, CA3) или зубчатая извилина (DG)) с помощью объектива 10x или 20x.
   2. Измените на 40-кратную или 63-кратную цель масляного погружения, чтобы убедиться, что анатомия среза не повреждена, определив непрерывные невриты и организованную структуру. Используйте в качестве эталона нейронный маркер, такой как MAP2 (рис. 1A).
   3. Затем переключитесь на объектив с 60-кратным погружением в масло (числовая апертура [NA] = ~1.3 - 1.4) и отрегулируйте настройки для каждого канала для получения оптимального сигнала и контраста. Используйте параметр с высокой/низкой контрастностью, чтобы установить интенсивность каждого лазера, чтобы избежать насыщения любых пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки будут зависеть от используемого микроскопа, но обратитесь к Таблице материалов для настройки мощности лазера. Для достижения наилучших результатов используйте разрешение 1024 x 1024 пикселя. Настройки должны оставаться постоянными в различных условиях одного и того же эксперимента. При необходимости можно применить дополнительное увеличение.
   4. Оцените глубину равномерного окрашивания и получите стеки изображений, по крайней мере, 8 равноудаленных (250 нм) плоскостей. Затем возьмите 3 смежных репрезентативных стека изображений из одной и той же области интереса на каждый срез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина может варьироваться от одного среза к другому, но всегда должна быть примерно на расстоянии 2 - 5 мкм от поверхности среза.
   5. Повторите сбор как минимум в 3 срезах на одно условие и от 6 до 8 животных на группу обработки.

Таблица 1: Буферы, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания.

0.50%PBS10x PBS KCl pH до 7.4

Blocking/permeabilizing Buffer	Concentration	Примечания
Donkey serum	10%
Triton-X <	<
1x	<
	pH до 7.4
NaCl	1.37 M	<
27 mM
NaH2PO4	100 mM	KH2PO4	18 mM		4% PFA/4% Sucrose	<
1x	Dilute from 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>

Результаты

Таблица 1: Буферы, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Блокирование/пермеабилизация буфера <td style='border:1.0pt solid black;padding:5.0pt;vertical-align:top;width:156.0pt;'>

Материалы