Микроскопический анализ синапсов в срезах гиппокампа мыши с использованием иммунофлюоресценции

Аннотация

Источник: McLeod, F., et al. Оценка плотности синапсов в срезах мозга грызунов гиппокампа. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео демонстрируется метод визуализации синаптических маркеров в срезах мозга гиппокампа с помощью конфокального иммунофлуоресцентного анализа. Срезы окрашивают первичными антителами, нацеленными на пресинаптические и постсинаптические маркеры, за которыми следуют флуорофор-конъюгированные вторичные антитела. Затем помеченные маркеры визуализируются с помощью конфокальной микроскопии для оценки синаптической архитектуры через их колокализацию.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.

1. Acute Hippocampal Slice Preparation

1. Удалите мозг мыши как можно быстрее, используя шпатель и острые ножницы, чтобы разрезать череп, и поместите его в ледяную, насыщенную кислородом (95% O₂, 5% CO₂) искусственную спинномозговую жидкость с высоким содержанием сахарозы (ACSF, ~ 100 мл).
2. Поместите мозг мыши на чашку Петри и удалите мозжечок и небольшой участок лобной коры с помощью скальпеля, прежде чем сбросить вниз по средней линии мозга.
3. Поместите два полушария на сторону, которая только что была вырезана, и приклейте каждое полушарие на сцену вибратома.
4. Отрежьте участки толщиной 200 - 300 мкм всей области интереса. В случае с гиппокампом следует получить примерно 3 – 4 среза на каждое полушарие.
5. Используя пластиковую пипетку Пастера, перенесите ломтики в камеру, погруженную в насыщенный кислородом (95% O₂, 5% CO₂) ACSF. Выдерживать при температуре 34 °C в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе срезы могут быть обработаны активными фармакологическими агентами, такими как рекомбинантные белки Dickkopf-1 (Dkk1), путем добавления агентов в камеру для срезов.
6. С помощью кисти удалите срезы из камеры, поместите их в 24-луночную пластину и зафиксируйте их на срок от 20 минут до 1 часа в 4% параформальдегиде (PFA)/4% сахарозе при комнатной температуре (RT).
   Внимание: PFA токсичен, носите соответствующую защиту.
7. Промойте ломтики три раза в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS, 10 мин каждый).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь на 1-2 дня, при условии, что срезы хранятся при температуре 4 °C в 1X PBS.

2. Иммунофлуоресценция для синаптических маркеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты всех используемых буферов можно найти в таблице 1.

1. В лунках для среза замените PBS на блокирующий/проникающий буфер (Таблица 1) и инкубируйте при RT в течение 4 - 6 часов.
2. Разбавьте поликлональное антитело морской свинки против везикулярного глутаматного транспортера 1 (vGlut1) в соотношении 1:2,000 в буфере для блокирования/пермеабилизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: vGlut1 - это маркер для пресинаптической возбуждающей терминальной визуализации. Для идентификации постсинаптического возбуждающего синапса используйте поликлональное антитело против постсинаптической плотности-95 (PSD-95) и разведите 1:500 в том же растворе. Используйте минимальный объем 300 мкл в каждой лунке. Чтобы определить анатомическое расположение гиппокампа, используйте антитело, которое также может идентифицировать нейронную структуру, например, ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2) или тубулин. Определите правильные концентрации всех первичных антител для синаптических маркеров выбора (пре- и постсинаптических) и разведите их в свежем блокирующем/пермеабилизирующем буфере.
3. Инкубируйте срезы в первичном растворе антител в течение ночи (или в течение 1-2 дней) при температуре 4 °C. Используйте платформу для встряхивания энергичными движениями.
4. Промойте ломтики три раза в PBS (по 10 минут каждый).
5. Разбавьте соответствующие вторичные антитела 1:500 в блокирующем буфере. Например, при использовании антитела к морской свинке vGlut1 применяют вторичное антитело, которое распознает компонент морской свинки (например, ослиную свинку против морской свинки), конъюгированный со специфическим флуорофором. При использовании антитела к кролику PSD-95 применяйте вторичное антитело, которое распознает компонент кролика (например, ослиный антикролик), конъюгированный с другим специфическим флуорофором.
6. Инкубируйте срезы в этом растворе в течение 2-3 часов на RT. Убедитесь, что срезы защищены от света, так как вторичные антитела чувствительны к свету.
7. Промойте ломтики три раза в PBS (по 10 минут каждый).
8. Осторожно удалите срезы с 24-луночной пластины с помощью кисти и равномерно разместите их на предварительно помеченных стеклянных предметных стеклах. Добавьте каплю монтажного средства поверх каждого ломтика, а затем аккуратно положите стеклянный покровный стекло поверх ломтиков. Не допускайте образования пузырьков воздуха. Следите за тем, чтобы использовать достаточное количество монтажной среды (300-400 μл), так как недостаточное количество может привести к высыханию ломтиков.
9. Оставьте сохнуть минимум на 1-2 дня в RT и держите слайды защищенными от света.
10. Храните слайды при температуре 4 °C в краткосрочной перспективе, но для долгосрочного хранения храните их при температуре -20 °C.

3. Получение и анализ

1. конфокальных изображенийВизуализация с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
   1. Определите область гиппокампа, которую нужно изобразить (например, роговые аммониас 1 и 3 (CA1, CA3) или зубчатая извилина (DG)) с помощью объектива 10x или 20x.
   2. Измените на 40-кратную или 63-кратную цель масляного погружения, чтобы убедиться, что анатомия среза не повреждена, определив непрерывные невриты и организованную структуру. Используйте в качестве эталона нейронный маркер, такой как MAP2 (рис. 1A).
   3. Затем переключитесь на объектив с 60-кратным погружением в масло (числовая апертура [NA] = ~1.3 - 1.4) и отрегулируйте настройки для каждого канала для получения оптимального сигнала и контраста. Используйте параметр с высокой/низкой контрастностью, чтобы установить интенсивность каждого лазера, чтобы избежать насыщения любых пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки будут зависеть от используемого микроскопа, но обратитесь к Таблице материалов для настройки мощности лазера. Для достижения наилучших результатов используйте разрешение 1024 x 1024 пикселя. Настройки должны оставаться постоянными в различных условиях одного и того же эксперимента. При необходимости можно применить дополнительное увеличение.
   4. Оцените глубину равномерного окрашивания и получите стеки изображений, по крайней мере, 8 равноудаленных (250 нм) плоскостей. Затем возьмите 3 смежных репрезентативных стека изображений из одной и той же области интереса на каждый срез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина может варьироваться от одного среза к другому, но всегда должна быть примерно на расстоянии 2 - 5 мкм от поверхности среза.
   5. Повторите сбор как минимум в 3 срезах на одно условие и от 6 до 8 животных на группу обработки.

Таблица 1: Буферы, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания.

0.50%PBS10x PBS KCl pH до 7.4

Blocking/permeabilizing Buffer	Concentration	Примечания
Donkey serum	10%
Triton-X <	<
1x	<
	pH до 7.4
NaCl	1.37 M	<
27 mM
NaH2PO4	100 mM	KH2PO4	18 mM		4% PFA/4% Sucrose	<
1x	Dilute from 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>

Результаты

Таблица 1: Буферы, используемые для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Блокирование/пермеабилизация буфера <td style='border:1.0pt solid black;padding:5.0pt;vertical-align:top;width:156.0pt;'>

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Vibratome	Leica	VT1000S
Первичное антитело	Millipore	AB5905	vGlut1 (1:2000)
Первичное антитело	Thermo Scientific	MA1-046	PSD-95 (1:500)
Первичное антитело	Synaptic Systems	131 004	vGAT (1:500)
Первичное антитело	Synaptic Systems	147011	Gephyrin (1:500)
Primary антитело	Abcam	ab5392	MAP2 (1:10000)
Вторичное антитело	Jackson Laboratories	706-545-148	Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)
Вторичное антитело	Abcam	ab175470	Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)
Монтажная среда	SouthernBiotech	00-4958-02	Fluoromount-G
Конфокальный микроскоп	Olympus	NA	FV1000 конфокальный микроскоп с масляной апертурой 60x 1.35 (NA). Для vGlut1 используйте лазер 488 с процентной мощностью 14%. Для PSD-95 используют лазер 559 с процентной мощностью 20%.
Analysis software	PerkinElmer	NA	Volocity
Scalpel	Swann-Morton	203	No 11
Super Glue	Loctite	1446875
95% O2, 5% CO2	BOC	NA	Цилиндр
24-луночная пластина	Corning	3524
Glass slides	Thermo	7107	08-1.0mm thick
Чашка Петри	Corning	430167	<
N/	A N/A	Мышей получали путем скрещивания трансгенных мышей tetO Dkk1 с трансгенными мышами CaMKIIα rtTA2. Трансгенные мыши TetO Dkk1 и CaMKIIα rtTA2 скрещивались в гетерозиготном состоянии. Обе линии мышей были выведены на фоне C57BL/6J. В качестве контроля использовали одиночного трансгенного однопометника и однопометника WT.
Реагенты для растворов:
NaCl	Sigma	V800372
KCl	Sigma	P9333
Na2HPO4	Sigma	255793
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	223506
MgCl2	Sigma	M9272
NaH2PO4	Sigma	71505
Kynurenic acid	Sigma	K3375
NaHCO3	Sigma	S5761
Pyruvinic acid	Sigma	107360
EDTA	Sigma	E6758
D-Glucose	Sigma	G5767
Sucrose	Sigma	S8501
Triton-X	Sigma	T8787
Donkey Serum	Millipore	S30-100ml
PFA	Sigma	P6148

td style='height:93.0pt;'>iDkk1 мыши