1. Приготовление органотипических ломтиков
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом рецепте используются два детеныша мыши на 7-9 день после рождения (стр. 7-9), в результате чего получается 24 органотипических ломтика, разделенных на две чашки для шестилуночных культур. Если не указано иное, все процедуры следует проводить в стерильном капюшоне, а также использовать нитриловые или латексные перчатки. Следует использовать только ингредиенты, пригодные для клеточных культур.
- Для подготовки среза использовались автоклавные бутылки, инструменты для препарирования (1 большой нож, 1 маленький нож, 1 большой плоский шпатель, 1 небольшой закругленный и заточенный шпатель и 1 щипцы; подробнее см. Список материалов), стеклянные пипетки, наконечники пипеток и салфетки для салфеток.
- Так как половина стеклянных пипеток должна быть использована с большим отверстием, отломайте узкий конец.
- Надрежьте алмазной ручкой (если таковая имеется) вокруг пипетки чуть ниже точки, где стекло начинает сужаться. Затем поместите заостренный конец пипетки в нитриловую перчатку или что-то подобное. Осторожно отломайте наконечник, согнув пипетку, одновременно прижимая ее к верстаку.
- Затем притупите сломанный конец, потерев его о кусок наждачной бумаги, или слегка расплавьте его на горелке Бунзена. Сломанные пипетки используются для переноса срезанных ломтиков мозга, при этом сломанный конец превращается в резиновую грушу, а большой открытый конец касается раствора/срезов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не делается в стерильном капюшоне и может быть сделано за несколько дней.
- Готовьте блюда из культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать за день до нарезки или по крайней мере за 2 часа до нарезки. - Стерилизовать мембраны из политетрафторэтилена (ПТФЭ) («конфетти»). С помощью двух стерильных щипцов удалите одно конфетти из окружающих синих пластиковых кусочков. Затем простерилизуйте, дважды опустив в чашку Петри, содержащую 96% этанола (EtOH). Затем положите конфетти в стерильную большую чашку Петри для просушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфетти представляют собой гидрофильные мембраны из ПТФЭ, похожие на мембраны во вставках для культур. Использование конфетти способствует визуализации в реальном времени, поскольку отдельные срезы можно легко перенести со вкладыша на микроскоп, подняв конфетти с помощью щипцов (подробнее см. 4.8). В качестве альтернативы, срезы мозга могут быть культивированы без конфетти (при этом срезы будут прикрепляться непосредственно к мембране вкладыша для культуры). В этом случае мембранную вставку необходимо разрезать скальпелем, чтобы перенести срез в ванну микроскопа. - Добавьте 1 мл питательной среды в каждую лунку шестилуночных чаш для культивирования.
- Поместите по одному культуральному вкладышу в каждую лунку с помощью стерильных щипцов. Избегайте образования пузырьков воздуха между вкладышем и питательной средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить деньги и окружающую среду, можно повторно использовать вставки культуры. Это можно сделать путем тщательного промывания в дистиллированной воде (dH2O) с последующей инкубацией в 70% EtOH в течение минимум 24 часов до повторного использования. При подготовке к новой культуре высушите вкладыши в планшете для клеточной культуры под ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 15-30 мин. - Поместите по два (стерилизованных и сухих) конфетти на каждую из вставок для культуры. Расположите конфетти по направлению к краям вставок, чтобы получить минимальное перекрытие.
- Поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C с 5% CO2.
- Пузырьковая среда для холодной диссекции с газообразным биоксидом (95% O2/5%CO2). Чтобы раствор оставался стерильным, подсоедините трубку от газового баллона к стерильному шприцевому фильтру (размер пор 0,22 мкм).
- Подсоедините другой конец шприцевого фильтра к стерильной трубке, соединенной со стерильной стеклянной пипеткой. Поместите стеклянную пипетку в раствор, накройте его парапленкой, и включите газ. Держите средство для рассечения на льду.
- Подготовьте область рассечения/нарезки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале эту процедуру следует проводить в стерильном капюшоне. Если такой возможности нет, вибратом можно оставить на верстаке. В этом случае рекомендуется использовать сетку для волос и маску для лица. - С помощью лезвия бритвы с одним лезвием вырежьте прямоугольный кусок (примерно 2 см х 0,5 см) агарозного геля и приклейте его на вибратомный столик так, чтобы длинная сторона была обращена к вибратомному лезвию.
- Очистите все поверхности и части вибратома 70% EtOH и протрите салфетками с автоклавной тканью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы все части, которые будут контактировать с тканью мозга, были полностью сухими, так как EtOH может повредить клетки. - Прикрепите к вибратому стерильное бритвенное лезвие и выполните вибрационную проверку, чтобы убедиться, что вибратом выполняет эту функцию.
- Поместите в капюшон автоклавные инструменты для вскрытия, салфетки для автоклавных тканей, четыре маленькие чашки Петри, скальпель с круглым краем, две стеклянные пипетки с резиновыми колбами, две стеклянные пипетки с открытым концом (см. п. 1.1) и суперклей (распыленный EtOH).
- Налейте пузырьковую среду для рассечения в вибратомную лодку и в четыре маленькие чашки Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует делать только непосредственно перед вскрытием, так как среда с этого момента не пузырится и не держится на льду.
- Препарируйте и монтируйте мозги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить здоровые ломтики, этот шаг должен быть выполнен быстро и точно. Нужна некоторая практика. - Усыпьте животное #1 путем вывиха шеи или в соответствии с местными правилами, а затем обезглавьте большими ножницами.
- С помощью небольших острых ножниц быстро снимите кожу, сделав сагиттальный разрез от шеи к носу и отведите его в сторону, чтобы обнажить череп.
- Разрез вдоль сагиттального шва с последующим боковым разрезом над внутренней частью лобных костей и ламбоидным швом (граница между головным мозгом и мозжечком).
- С помощью щипцов разогните череп с каждой стороны. Черепно-мозговые нервы отрезают от мозга путем введения округлого острого шпателя под вентральную сторону мозга и осторожного перемещения шпателя в сторону.
- Используйте лезвие бритвы с одним лезвием, чтобы сделать корональный разрез ростраль к мозжечку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот разрез определит угол, под которым срезаются ломтики. Поэтому он должен быть сделан под прямым углом. - Вытащите мозг из черепа в маленькую чашку Петри, содержащую средство для вскрытия.
- Повторите шаги 1.6.1. - 1.6.4. для животного #2 и поместите этот мозг во вторую чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные не стерильны. Выполните вскрытие с одной стороны капюшона, а затем перейдите на другую, чистую сторону, как только мозг будет удален из черепа. - Смените перчатки.
- Прикрепите мозг к вибратомной сцене: добавьте тонкий слой суперклея на сцену прямо перед установленным агарозным гелем. Держите мозг #1 большим плоским шпателем так, чтобы свежевырезанная (каудальная) сторона касалась шпателя, а вентральная сторона была обращена (и максимально близко к) агарозному гелю.
- Затем аккуратно поместите мозг на клей, оттолкнув его от шпателя с помощью набора щипцов. Убедитесь, что оставили достаточно места для мозга #2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы мозги были хорошо прикреплены к сцене, но без чрезмерного количества клея, так как это может помешать резке.
- Сразу после установки мозга #1 с помощью большого шпателя добавьте несколько капель диссекционного средства на верхнюю часть мозга. Это сохранит мозг влажным, затвердеет клей и предотвратит его прилипание к бокам мозга.
- Повторите шаги 1.6.7 и 1.6.8. Для мозга #2.
- Прикрепите сцену к вибратомной лодке.
- Нарежьте корональные срезы толщиной 230 мкм с амплитудой 1 - 1,5 мм, частотой 85 Гц и скоростью 0,2 мм/с. Соберите ломтики примерно между 1,4 мм ростралью и 2,1 мм каудально до брегмы.
- Собирайте ломтики после того, как каждый ломтик был разрезан, с помощью стеклянных пипеток с открытым концом (п. 1.1). Переложите ломтики в чашку Петри, содержащую среду для препарирования. С помощью закругленного скальпеля разрежьте ломтики на две части, разделив два полушария.
- Когда все ломтики будут нарезаны, выложите ломтики в посуду для культуры.
- Выньте чашку для культуры (по одной) из инкубатора.
- С помощью стеклянных пипеток с открытым концом осторожно переложите по одному ломтику на каждую из конфетти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ломтики должны лежать ровно в середине конфетти. Для этого нужна определенная сноровка. Однако, если некоторые срезы не идеальны, лучше оставить их, чем тратить время на попытки их переместить, так как важно как можно быстрее доставить все срезы в инкубатор. - С помощью стеклянной пипетки (заостренным концом) аккуратно удалите излишки среды, не касаясь среза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ломтики не следует погружать в жидкость во время инкубации. Таким образом, избыток среды необходимо отсасывать таким образом, чтобы ломтики подвергались воздействию воздуха (тонкая пленка среды все равно покроет ломтики). Ломтики, которые остаются погруженными в жидкость, обычно вредны для здоровья или отмирают (4 и наши наблюдения). - Переместите блюдо обратно в инкубатор, как только все конфетти составят один ломтик.
- Повторите шаги 1.7.8. - 1.8.4. Для блюда #2.
- Смените питательную среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует делать на следующий день после нарезки (день 1 in vitro, DIV1) и затем каждые 2-3 дня. - Разогрейте питательную среду на водяной бане или в инкубаторе.
- В стерильном колпаке используйте вакуумную аспирацию или обычную пипетку со стерильным наконечником для аспирации питательной среды из каждой лунки. Для этого нужно аккуратно наклонить чашку (примерно на 30 градусов) и поместить наконечник пипетки на край вставки для культуры.
- Удалите примерно 800 мкл из каждой лунки (оставив ровно столько среды, чтобы дно вкладыша было покрыто средой). Затем с помощью чистой пипетки добавьте в каждую лунку по 800 мкл предварительно нагретой среды. Затем поместите чашки обратно в инкубатор для клеточных культур.
2. Вирусная трансдукция
- Приобретите или изготовьте аденоассоциированные вирусы (AAV) с интересующей плазмидой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает использование AAV серотипа 2/8 (AAV 2/8), несущего митохондриальный целевой dsred или GFP, в качестве репортерного гена под транскрипционным контролем промотора основного белка миелина12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred или AAV2/8 MBP_mito_GFP) для визуализации митохондрий олигодендроцитов. AAV 2/8, несущий GFP или tdtomato в качестве репортерного гена, управляемого общим промотором CAG (AAV 2/8 CAG_GFP или AAV 2/8 CAG_tdtomato), используется для визуализации цитоплазмы олигодендроцитов. Так, комбинация AAV2/8 MBP_mito_dsred с AAV 2/8 CAG_GFP дает красные митохондрии и зеленую цитоплазму в олигодендроцитах, тогда как комбинация AAV2/8 MBP_mito_GFP и AAV 2/8 CAG_tdtomato дает зеленые митохондрии и красную цитоплазму. Более подробно эти конструкции описаны в другом месте13. - На 7-й день in vitro (DIV7) проводят трансдуцирование олигодендроцитов с AAV.
ВНИМАНИЕ: Соблюдайте правила безопасности при работе с AAV. Убедитесь, что у вас есть соответствующее обучение и требуется одобрение уровня биобезопасности. Все следующие пункты следует выполнять в шкафу биобезопасности класса II с использованием перчаток и лабораторного халата. Здесь описывается применение AAV к области коры головного мозга срезов, так как именно эта область показывает наилучшее восстановление. - Разведите AAV в предварительно нагретой (37 °C) питательной среде. Рекомендуется разведение около 2 × 109 копий генома/мл (GC/мл) для получения разреженной трансдукции олигодендроцитов, которая позволяет визуализировать отдельные клетки в пределах среза. Тем не менее, необходимо провести пилотный эксперимент с использованием различных титров, чтобы обеспечить плотность трансдуцированных олигодендроцитов, подходящую для конкретных экспериментов. Если используются два разных AAV, их следует смешать в одном растворе и добавить в ломтик одновременно.
- Добавьте около 1,3 мкл разбавленного AAV в каждый ломтик. Убедитесь, что наконечник пипетки находится на сухой стороне. Пипетку разбавьте 1,3 мкл AAV и держите пипетку над корой как можно ближе, не касаясь среза кончиком пипетки (на расстоянии около 1 мм).
- Затем медленно вытолкните раствор из пипетки. Когда раствор коснется среза, переместите наконечник пипетки над корой головного мозга, чтобы распределить раствор по всей области коры головного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру следует выполнить как можно быстрее, чтобы избежать удержания ломтиков вне капюшона дольше, чем это необходимо. Проделывайте это с одной посудой за раз и положите первую чашку обратно в инкубатор, прежде чем приступать к блюду #2. Чтобы получить удовлетворительное распределение AAV без повреждения тканей, требуется некоторая практика и твердая рука.
- Если в клеточной лаборатории имеется вертикальный флуоресцентный микроскоп, экспрессию белка можно проверить в течение времени в культуре, поместив чашку под микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блюдо не следует держать вне инкубатора более 2 - 5 минут.
3. Покадровая визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть выполнена, когда уровни экспрессии флуоресцентных маркеров достаточны, и срезы выглядят здоровыми (обычно DIV11-14).
- Убедитесь, что микроскоп, перфузия и нагрев настроены правильно, чтобы раствор для визуализации с пузырьками нагревался и мог входить в ванну и выходить из нее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные решения для камер для ванн. Здесь представлен простой вариант. - Сделайте входы и выходы из ванны с помощью затупленных игл шприца (согнутых под углом ~45°), которые прикреплены к стенкам ванны с помощью прихватки.
- Убедитесь, что трубка проходит от бутылки с непрерывно пузырьковым раствором для визуализации через перистальтический насос через нагревательную трубку нагревательного блока, а затем к игле входного шприца в ванне.
- Подсоедините другую трубку к выходному отверстию иглы шприца. Затем эта трубка проходит через перистальтический насос обратно в бутылку с раствором для визуализации (или в бутылку с отходами).
- Раствор для визуализации пузырей с газообразным биоксидом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть начато по крайней мере за 15 минут до визуализации и продолжаться на протяжении всего эксперимента. - Включите перистальтический насос и нагреватель и пропустите раствор через ванну для получения оптимальной температуры ванны (37 ± 0,5 °C). Убедитесь, что датчик термометра, подключенный к термометру, погружен в раствор для ванны.
- Включите микроскоп, флуоресцентную лампу и соответствующие лазеры.
- Настройте подходящий световой путь для образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это зависит от настройки микроскопа и зонда. Общие знания о том, как пользоваться конфокальным микроскопом, требуются и здесь рассматриваться не будут. - Используйте водно-иммерсионный объектив с соответствующим увеличением и числовой апертурой (н.а.). Мы используем 40-кратный план погружения в воду - апохроматный объектив (n.a. 1.0).
- Открытое отверстие для получения оптического сечения примерно 2 - 2,5 мкм для интервальной видеосъемки. Это снижает частоту смещения митохондрий из фокуса во время покадровой съемки.
- Переложите органотипический срез в ванну:
- }Добавьте каплю раствора для визуализации или питательной среды в маленькую пластиковую чашку Петри.
- В стерильном капюшоне используйте стерильные щипцы для переноса одного органотипического среза из мембранного вкладыша в каплю. Щипцы должны касаться только конфетти, а не среза.
- Накрываем чашку Петри крышкой.
- Сразу же поставьте чашку с культурой, содержащую остальные ломтики, обратно в инкубатор.
- Поднесите чашку Петри с ломтиком к микроскопу.
- Выключите перистальтическую помпу во время переноса среза в ванну с микроскопом. Сначала с помощью щипцов поднимите конфетти с ломтиком из чашки Петри на верх ванны (конфетти будет плавать). Затем поместите два кончика щипцов с каждой стороны конфетти так, чтобы они касались конфетти, не касаясь среза, и протолкните конфетти через раствор на дно ванны. Выложите конфетти по центру в центре ванны.
- С помощью щипцов поместите прижимной якорь (арфу) поверх конфетти, не касаясь среза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Арфа - это платиновый якорь в форме подковы, который используется для предотвращения плавания или дрейфа куска в ванне. Для острых срезов тонкие струны проходят от одной стороны арфы к другой (напоминая музыкальную арфу). Для органотипических ломтиков арфа должна быть без струн и подходить по размеру к конфетти таким образом, чтобы она могла лежать поверх конфетти, не касаясь ломтика. - Снова включите перистальтический насос.
- Опустите объектив вниз к образцу.
- Выберите ячейку и регион для изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного воздействия лазерного света на клетки, так как это может привести к токсичности клеток (см. советы в пунктах ниже). - Используйте окуляры и люминесцентную лампу, чтобы найти здоровый на вид олигодендроцит с правильным выражением. Как правило, олигодендроциты, которые имеют сильную сверхэкспрессию флуоресцентного белка, выглядят нездоровыми. У нездоровых олигодендроцитов отростки будут иметь пузырчатый вид, а митохондрии будут казаться фрагментированными. У здоровых олигодендроцитов сома и отростки кажутся гладкими, а митохондрии имеют различную длину (хотя обычно они намного короче, чем у нейронов и астроцитов).
- Поместите интересующую вас ячейку в центр поля зрения.
- Используйте функцию «живой» в программном обеспечении (для микроскопов Leica и Zeiss), чтобы идентифицировать клетку на экране и выбрать интересующую область, например, часть клетки, содержащую несколько первичных отростков или миелиновых оболочек, или один отросток или миелиновую оболочку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы иметь возможность отобразить как можно больше процессов/оболочек, выбирайте области, содержащие процессы, которые лежат относительно плоски в направлении x-y. - Увеличьте интересующее поле (обычно создавая изображение с размером пикселя 0,14–0,30 мкм).
- С помощью инструмента «регионы» нарисуйте прямоугольник вокруг области и выберите вариант сканирования только выделенной области. Время сканирования, а значит, и лазерного воздействия, сокращается за счет сканирования только выбранной области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Горизонтальные прямоугольные области будут сканироваться быстрее, чем вертикальные, из-за меньшего количества необходимых сканируемых линий. Если сканируется область вертикального прямоугольника, время сканирования можно сократить, повернув поле сканирования на 90 градусов (с помощью инструмента поворота).
- Отрегулируйте мощность и усиление лазера, чтобы получить хороший обзор митохондрий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимально необходимую мощность лазера. Если возможно, увеличивайте усиление, а не мощность лазера. Помимо токсичности клеток, слишком высокая мощность лазера со временем приводит к обесцвечиванию визуализируемых объектов, что требует дальнейшего увеличения мощности лазера или усиления во время сканирования. Требуемая мощность и усиление лазера будут зависеть от уровня экспрессии и микроскопа. В конфокальном микроскопе LSM700 мы используем лазер с длиной волны 555 нм мощностью 20-40 мкВт для получения изображения dsred или tdtomato, а лазер с длиной волны 488 нм используется с длиной волны 20 - 30 мкВт для изображения GFP (мощность лазера, измеренная на задней апертуре объектива). Коэффициент усиления устанавливается высоким для изображения в реальном времени, обычно в диапазоне 700 - 800 для GFP и 850-980 для dsred и tdtomato. Высокий коэффициент усиления может привести к дополнительному фоновому шуму, который устраняется за счет увеличения цифрового смещения (значения смещения обычно находятся в диапазоне от 0 до 15). По нашему опыту, использование MBP_mito_GFP дает лучшее соотношение сигнал/шум, чем MBP_mito_dsred. - Выберите скорость сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте время сканирования, используя высокую скорость сканирования и рисуя небольшую область сканирования (см. пункт 4.10.5 ниже). Также можно сэкономить время сканирования, выполнив двунаправленное сканирование. Однако это не рекомендуется из-за более низкого качества изображения. - Установите частоту и продолжительность покадровой записи, например, делайте снимки каждые 2 секунды в общей сложности 20 минут для митохондриальной визуализации в олигодендроцитах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота и продолжительность должны быть установлены в соответствии с подвижностью интересующих объектов. Более высокая частота подвергает образец большему воздействию лазерного света, но более быстро движущиеся объекты также требуют более короткой общей продолжительности покадровой видеосъемки (например, митохондрии в нейронах, которые движутся чаще и с гораздо большей скоростью, чем митохондрии в олигодендроцитах, обычно визуализируются каждую секунду в общей сложности 2 минуты). - Запустите цейтраферную запись.
ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии могут смещаться из фокуса и/или дрейфовать за пределы отображаемой области во время записи. Чтобы свести к минимуму вибрации и движение, отрегулируйте вход и выход ванны и при необходимости уменьшите частоту вращения насоса. Небольшие изменения в фокусе обычно все же происходят. Таким образом, требуется непрерывный контроль за экраном во время съемки, с небольшими корректировками фокусировки во время записи.
Захват z-стека всей ячейки для последующей идентификации ячейки и процесса визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего разрешения, отверстие должно быть сброшено на 1 воздушную единицу для z-стека.