Двухфотонная микроскопия для изучения притяжения микроглиального процесса к соединению в срезе мозга мыши

Аннотация

Источник: Этьен, Ф. et al. Двухфотонная визуализация притяжения микроглиальных процессов к АТФ или серотонину в острых срезах мозга. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует использование двухфотонной микроскопии для изучения притяжения микроглиальных процессов к инъецируемому соединению в срезах мозга. В нем представлен обзор подготовки срезов мозга мышей, введения тестового соединения хемоаттрактанта и визуализации флуоресцентно меченой микроглии для визуализации их реакции.

Протокол

1. Двухфотонная микроскопия

1. Parameters setting
   1. Включите многофотонную систему (гибридные детекторы, лазер, сканер, электрооптический модулятор, микроскоп).
   2. NOTE:NOTE:т.е., не самые глубокие z-срезы, где флуоресценция слабая]), или для снижения скорости работы сканера. Осевое разрешение также может быть уменьшено путем увеличения z-шага до 3 мкм, но поскольку это может повлиять на количественную оценку, все сравниваемые эксперименты должны выполняться с одним и тем же z-шагом.
      NOTE: ^GFP/+Позиционирование среза и стеклянной микропипетки, а также локальное применение compound
      1. Подключите перистальтический насос к камере записи за 30 минут до начала записи. После очистки всей перфузионной системы 50 мл сверхчистой воды, начните перфузию записывающей камеры с КСФ (50 мл), содержащимся в стеклянном стакане, под постоянной карбогенацией. На протяжении всего эксперимента поддерживайте температуру циркулирующего аКСФ на уровне 32 °C с помощью встроенного микронагревателя или нагревателя Пельтье.
         NOTE:Figure 1A,BNOTE:NOTE: NOTE: ^-1Рисунок 2B).
      2. NOTE: ., более заметный в последнем, чем в первом срезе мозга, который будет изображен). Таким образом, z-плоскости в первых ~30 мкм не должны использоваться для анализа и даже могут быть пропущены для получения данных.
      3. NOTE:2. Анализ привлекательности микроглиальных процессов
         1. 2D проекция и коррекция смещения
            1. Откройте файл (. LIF) с Фиджи.
            2. Image/Stacks/Tools/Make substackZ project функция (Image/Stacks/Z Project") и выберите Max Intensity тип проекции для создания проекций z-стека, полученных в каждый момент времени точка.
            3. MultiStackReg плагин (Plugin/Registration/MultiStackReg), выбирая Action 1: Align и Transformation: Rigid BodyData processing
               1. Откройте этот новый файл с Icy.
               2. R1ROI intensity evolution и измерьте среднюю интенсивность за время в R1.
               3. Количественная оценка и представление результатов
                  1. Чтобы количественно оценить реакцию микроглии с течением времени, определите в каждый момент времени.
                     Затем результаты могут быть представлены в виде кинетики микроглиального ответа или в определенный момент времени (см. Figure 3).

Результаты

Рисунок 1: Детали интерфейсной камеры. (A) Контур для 3D-печати держателя для слайсов. Внешний диаметр держателя составляет 7 см. (B) Интерфейсный держатель для срезов с нейлоновой сеткой (стрелка), которая позволяет исследователям удерживать срезы на границе раздела жидкость-воздух. (C) Устройс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
for slice imaging<		<
Leica Microsystems (Германия)<
2-фотонный вертикальный микроскоп MP5 с резонансными сканерами (8 кГц) и двумя детекторами HyD Hybrid	Leica Microsystems (Германия)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump	DD Biolab	178961	Для перфузии 2-фотонной камеры с aCSF
Carbogen 5% углекислого газа/95% кислорода	Air Liquide France Industrie
Chameleon Ultra2 Ti:сапфировый лазер	Coherent (Германия)
Одноразовые переводные пипетки, широкий рот	ThermoFischer scientific	5.8ml с плавником, но мы отрезали его (около 7 см), чтобы иметь рот диаметром 4 мм
Emission filter SP680<		<
Leica Microsystems (Германия)
Стеклянный стакан с 50 мл ACSF для поддержания постоянной перфузии ломтика		<
Heating system	Warner Instrument Corporation	Контроллер автоматического нагревателя TC-324B	для поддержания перфузионного раствора при температуре 32°C
Perfusion chamber<		home-made, файл для 3D-печати предоставлен в Supplemental Material
Slice holder ("harp")<	<
	<
Sigma	A-26209	для временного приготовления: 1 мг/мл (3 мМ) стокового раствора, приготовленного в день эксперимента, выдерживаемого при 4°C (несколько часов) и разбавленного непосредственно перед использованием
Fluorescein (опционально)	Sigma	F-6377	use at 1 μM final
Micromanipulator	Луигс и Нейман	SM7	connected to the micropipette holde
держатель микропипетки<	то же, что и для eletrophysiology<
Серотонина гидрохлорид	Sigma	H-9523	аликвоты 50 мМ стокового раствора в H20 выдерживали при -20°С. 500 мМ раствор готовили в день эксперимента.
Шприц 5mL (без иглы)	Terumo medical products	<
Прозрачная трубка	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
For image analysis
Fiji		https://fiji.sc
Icy	Institut Pasteur	http://icy.bioimageanalysis.org
Mice	<
CX3CR1-GFP мыши	Jung et al, 2000<	кобели или суки в возрасте от P3 до 2 месяцев; Мы скрестили этих мышей на фоне 129SV.
CX3CR1creER-YFP mice	Parkhurst et al 2013	<

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> tr style='height:24px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:top;'>HCX Irapotd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Leica Microsystems (Германия)tr style='height:24px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>home made: шпилька из платины с двумя ветвями, соединенными параллельными нейлоновыми нитямиtr style='height:24px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> <td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>tr style='height:24px;'>tr style='height:24px; '>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:top;'> td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>самцы или самки, от P3 до 2 месяцев; мы скрестили этих мышей на фоне 129sv.