Двухфотонная микроскопия для изучения притяжения микроглиального процесса к соединению в срезе мозга мыши

Abstract

Источник: Этьен, Ф. et al. Двухфотонная визуализация притяжения микроглиальных процессов к АТФ или серотонину в острых срезах мозга. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует использование двухфотонной микроскопии для изучения притяжения микроглиальных процессов к инъецируемому соединению в срезах мозга. В нем представлен обзор подготовки срезов мозга мышей, введения тестового соединения хемоаттрактанта и визуализации флуоресцентно меченой микроглии для визуализации их реакции.

Protocol

1. Двухфотонная микроскопия

1. Parameters setting
   1. Включите многофотонную систему (гибридные детекторы, лазер, сканер, электрооптический модулятор, микроскоп).
   2. NOTE:NOTE:т.е., не самые глубокие z-срезы, где флуоресценция слабая]), или для снижения скорости работы сканера. Осевое разрешение также может быть уменьшено путем увеличения z-шага до 3 мкм, но поскольку это может повлиять на количественную оценку, все сравниваемые эксперименты должны выполняться с одним и тем же z-шагом.
      NOTE: ^GFP/+Позиционирование среза и стеклянной микропипетки, а также локальное применение compound
      1. Подключите перистальтический насос к камере записи за 30 минут до начала записи. После очистки всей перфузионной системы 50 мл сверхчистой воды, начните перфузию записывающей камеры с КСФ (50 мл), содержащимся в стеклянном стакане, под постоянной карбогенацией. На протяжении всего эксперимента поддерживайте температуру циркулирующего аКСФ на уровне 32 °C с помощью встроенного микронагревателя или нагревателя Пельтье.
         NOTE:Figure 1A,BNOTE:NOTE: NOTE: ^-1Рисунок 2B).
      2. NOTE: ., более заметный в последнем, чем в первом срезе мозга, который будет изображен). Таким образом, z-плоскости в первых ~30 мкм не должны использоваться для анализа и даже могут быть пропущены для получения данных.
      3. NOTE:2. Анализ привлекательности микроглиальных процессов
         1. 2D проекция и коррекция смещения
            1. Откройте файл (. LIF) с Фиджи.
            2. Image/Stacks/Tools/Make substackZ project функция (Image/Stacks/Z Project") и выберите Max Intensity тип проекции для создания проекций z-стека, полученных в каждый момент времени точка.
            3. MultiStackReg плагин (Plugin/Registration/MultiStackReg), выбирая Action 1: Align и Transformation: Rigid BodyData processing
               1. Откройте этот новый файл с Icy.
               2. R1ROI intensity evolution и измерьте среднюю интенсивность за время в R1.
               3. Количественная оценка и представление результатов
                  1. Чтобы количественно оценить реакцию микроглии с течением времени, определите в каждый момент времени.
                     Затем результаты могут быть представлены в виде кинетики микроглиального ответа или в определенный момент времени (см. Figure 3).

Results

Рисунок 1: Детали интерфейсной камеры. (A) Контур для 3D-печати держателя для слайсов. Внешний диаметр держателя составляет 7 см. (B) Интерфейсный держатель для срезов с нейлоновой сеткой (стрелка), которая позволяет исследователям удерживать срезы на границе раздела жидкость-воздух. (C) Устройс...

Materials