Микроскопическая визуализация нейронов в срезе мозга мыши с использованием металлического окрашивания по методу Гольджи-Кокса

Аннотация

Источник: Лаут, Э. Л., и др. Визуализация нейронов в толстых срезах мозга с помощью метода Гольджи-Кокса. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует визуализацию нейронов в толстом участке мозга, окрашенном по методу Гольджи-Кокса, путем установки верхних и нижних границ фокусировки и захвата перекрывающихся изображений. Несколько мест визуализируются для обеспечения детальных нейронных проекций, которые объединяются для создания 3D-представления.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.

1. Окрашивание

1. по методу Гольджи-КоксаПропитка мозгов по методу Гольджи-Кокса
   1. Приготовьте раствор Гольджи-Кокса из 1% (w/v) дихромата калия, 0,8% (w/v) хромата калия и 1% (w/v) хлорида ртути, растворив дихромат калия и хромат калия отдельно в качественную воду. Смешайте растворы, добавьте хлорид ртути и отфильтруйте окончательный раствор с помощью фильтровальной бумаги класса 1. Храните раствор в темноте до одного месяца.
   2. Обезболите мышь, используя 5% изофлурана.
   3. Усыпьте мышь путем обезглавливания и быстро удалите мозг.
   4. Поместите мозг в стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 мл, содержащий 17 мл раствора Гольджи-Кокса, и инкубируйте в темноте при RT в течение 25 дней.
   5. Криозащитите мозг, поместив его в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 40 мл криопротектора сахарозы (30% (w/v) сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4) в темноте при 4 °C в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие три необязательных шага могут быть использованы в качестве альтернативы основному протоколу, чтобы заморозить мозг на этом этапе для долгосрочного хранения.
   6. Заморозьте весь мозг, погрузив его в 200 мл изопентана, предварительно охлажденного на сухом льду.
   7. Поместите замороженный мозг в коническую пробирку объемом 50 мл и храните ее в темноте при температуре -80 °C.
   8. Когда будете готовы продолжить, разморозьте мозг, поместив его в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 40 мл криопротектора сахарозы, и подержав его в темноте при температуре 4 °C в течение 24 часов.
2. Brain Sectioning
   1. Удалите мозг из сахарозы и заблокируйте его для разделения, отрезав мозжечок с помощью лезвия бритвы и оставив плоский край на оставшемся каудальном конце мозга.
   2. Нагрейте агар (3% (w/v) в воде) до тех пор, пока он не растает, затем дайте ему остыть, пока он не станет немного выше точки плавления.
   3. Поместите мозг в маленькую одноразовую чашку для взвешивания каудальным концом вниз и добавьте достаточное количество расплавленного агара, чтобы покрыть его.
   4. Как только агар застынет, обрежьте излишки агара, оставив примерно 2-4 мм вокруг мозга, и приклейте мозг к сцене вибратома каудальным концом лицевой стороной вниз, используя небольшое количество этилцианоакрилатного клея.
   5. Заполните область вибратома достаточным количеством криопротектора сахарозы, чтобы покрыть мозг, и разрежьте мозг на толщину среза 400 - 500 μм (в зависимости от исследуемой области мозга), используя частоту вибрации 86 Гц и скорость продвижения лезвия 0,125 мм/с.
   6. Используя маленькую кисть, поместите срезы мозга в лунку 6-луночного планшета для культуры тканей, содержащего имеющиеся в продаже вставки с сетчатым дном и предварительно заполненного 10 мл 6% (w/v) сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4.
   7. Инкубируйте секции в темноте при 4 °C O/N.
3. Developing Brain Sections
   1. Перенесите срезы мозга в новую лунку, содержащую 5 мл 2% (w/v) параформальдегида (PBD) в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4, используя вставки с сетчатым дном. Инкубируйте на коромысле, медленно двигаясь в темноте при RT в течение 15 минут.
   2. Секции следует промыть дважды, перенеся их в новые колодцы, содержащие 5 мл воды. Стирать их следует на коромысле, движущемся с умеренной скоростью в темноте по RT в течение 5 минут.
   3. Перенесите секции в новую лунку, содержащую 5 мл 2,7% (v/v) гидроксида аммония. Инкубируйте на коромысле, медленно двигаясь в темноте при RT в течение 15 минут.
   4. Секции следует промыть дважды, перенеся их в новые колодцы, содержащие 5 мл воды. Стирать их следует на коромысле, движущемся с умеренной скоростью в темноте по RT в течение 5 минут.
   5. Перенесите секции в новую лунку, содержащую 5 мл фиксатора А, разведенного в воде в 10 раз от его первоначальной концентрации. Инкубируйте на коромысле, медленно двигаясь в темноте при RT в течение 25 минут.
   6. Секции следует промыть дважды, перенеся их в новые колодцы, содержащие 5 мл воды. Стирать их следует на коромысле, движущемся с умеренной скоростью в темноте по RT в течение 5 минут.
4. Монтаж разделов мозга
   1. Используя маленькую кисть, закрепите секции на предметных стеклах микроскопа. С помощью пинцета и небольшой салфетки удалите лишнюю воду и агар. Убедитесь, что весь агар удален, прежде чем приступать к обезвоживанию.
   2. Дайте секциям высохнуть на воздухе при RT примерно 45 минут (секции 400 мкм) или 90 мин (секции 500 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время и надлежащий уровень сухости имеют решающее значение и, возможно, потребуется определить в каждой лаборатории в зависимости от температуры окружающей среды и влажности. Слишком короткое время сушки приводит к тому, что секции отваливаются от предметных стекол на последующих этапах обезвоживания, а слишком длительное время сушки приводит к растрескиванию секций. Участки по-прежнему будут выглядеть блестящими при соответствующем уровне сухости.
   3. Окрасьте секции в фиолетовый цвет, поместив слайды в банки для окрашивания Coplin, как указано.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот необязательный шаг может быть использован для участков, которые никогда не были заморожены для окрашивания нейронных ядер крезиловым фиолетовым. Мы обнаружили, что очистка и регидратация секций перед инкубацией в кресильном фиолетовом цвете приводит к равномерному окрашиванию и низкому фону на всех срезах.
      1. Поместите в клиринг-агент на 5 мин. Повторите один раз.
      2. Поместите в 100% этанол на 5 мин. Повторите один раз.
      3. Поместите 95% этанола в воду, затем 75% этанола в воду, а затем 50% этанола в воду на 2 минуты каждый.
      4. Поместите в воду на 5 минут.
      5. Поместите в 0,5% (w/v) cresyl violet в воду на 7 минут.
      6. Поместите в воду на 2 мин. Повторите один раз.
   4. Обезвоживайте секции, помещая слайды в банки для окрашивания Coplin, как указано.
      1. Поместите 50% этанола в воду, затем 75% этанола в воду, а затем 95% этанола в воду на 2 минуты каждый.
      2. Поместите в 100% этанол на 5 мин. Повторите один раз.
      3. Поместите в клиринг-агент на 5 мин. Повторите один раз.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это время обезвоживания и очищения достаточно для обработки мышиного мозга, как описано в этой рукописи. Тем не менее, мы заметили, что для других видов, включая крыс и коровьих птиц, заключительный этап очистки может потребоваться продлить в общей сложности до 15 минут.
   5. Секции покровного стекла с использованием безводной монтажной среды.
   6. Дайте слайдам высохнуть горизонтально в темноте при RT не менее 5 дней.

2. Визуализация окрашенных нейронов в толстых срезах

1. мозгаCapture Image Stacks
   1. Включите лампочку микроскопа, камеру и контроллер сцены.
   2. Откройте программное обеспечение микроскопа (например, Neurolucida).
   3. Поместите слайд на столик микроскопа.
   4. Захватите 2D-изображение области мозга с широким углом обзора, используя объектив с низким увеличением, такой как 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO или 4X 0.16 N.A.
      1. Сосредоточьтесь на изображении и настройте параметры камеры, включая время экспозиции и баланс белого.
      2. Создайте точку отсчета, щелкнув левой кнопкой мыши в любом месте раздела
      3. Захватите изображение, выбрав "получить одно изображение" в окне получения изображения.
   5. Захватите стеки изображений со средним разрешением области, содержащей интересующие нейроны, используя объектив 10X 0.3 N.A. UPlan FL N.
      1. Сосредоточьтесь на изображении и отрегулируйте настройки камеры, включая экспозицию и баланс белого.
      2. Установите верхнюю и нижнюю границы для стека изображений, сосредоточившись на верхней части раздела и выбрав "установить" рядом с "вершиной стопки" в окне получения изображения, а затем сфокусируйтесь на нижней части раздела и выбрав "установить" рядом с "нижней частью стопки" в окне получения изображения.
      3. Установите расстояние шага на 5 мкм, введя "5 мкм" рядом с "расстоянием между изображениями" в окне получения изображений.
      4. Захватите стек изображений, выбрав "получить стек изображений" в окне получения изображений.
      5. Повторите описанные выше шаги, чтобы захватить всю интересующую область, убедившись, что все стеки изображений перекрываются как минимум на 10% по осям X и Y.
   6. Захватите стеки изображений с высоким разрешением области, содержащей интересующий нейрон, используя объектив для погружения в силиконовое масло 30X 1.05 N.A.
      1. Нанесите 3-4 капли силиконового иммерсионного масла на слайд и поместите объектив на слайд, обеспечивая контакт между объективом и маслом.
      2. Сосредоточьтесь на изображении и отрегулируйте настройки камеры, включая экспозицию и баланс белого.
      3. Установите верхнюю и нижнюю границы для стека изображений, сосредоточившись на верхней части раздела и выбрав "установить" рядом с "вершиной стопки" в окне получения изображения, а затем сфокусируйтесь на нижней части раздела и выбрав "установить" рядом с "нижней частью стопки" в окне получения изображения.
      4. Установите расстояние шага на 1 мкм, введя "1 мкм" рядом с "расстоянием между изображениями" в окне получения изображений.
      5. Захватите стек изображений, выбрав "получить стек изображений" в окне получения изображений.
      6. Повторите описанные выше шаги, чтобы захватить всю интересующую область, убедившись, что все стеки изображений перекрываются как минимум на 10% по осям X и Y.
   7. Сохраните файл данных и все файлы изображений в формате TIFF для внешней обработки.
2. Создание Z-проекционных изображений и монтажей изображений
   1. Создание изображений Z-проекции в ImageJ
      1. Откройте программу ImageJ, в которой установлен плагин Bio-Formats.
      2. Select "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats Importer."
      3. Выберите файл стека изображений, который нужно открыть.
      4. Как только файл будет открыт, измените формат на RGB, выбрав "Изображение" -> "Тип" -> "RGB Color".
      5. Создайте Z-проекцию, выбрав "Image" -> "Stacks" -> "Z Project...".
      6. Сохраните двухмерное изображение Z-проекции в виде файла TIFF.
   2. Создайте двухмерный монтаж изображений всей области интереса.
      1. Откройте программное обеспечение (например, Adobe Photoshop).
      2. Select "File" -> "Automate" -> "Photomerge".
      3. Выберите "Обзор", а затем добавьте все файлы изображений для объединения.
      4. Убедитесь, что выбран параметр "Blend Images", а затем выберите "OK".
      5. Сохраните полученное монтажное изображение всей интересующей области в виде файла TIFF.

Материалы