Визуализация активации нейронов гиппокампа в срезах мозга мышей

Аннотация

Источник: Provenzano, G., et al. Иммуногистохимическая визуализация активности нейронов гиппокампа после пространственного обучения в мышиной модели нарушений развития нервной системы. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует иммуногистохимическую визуализацию для визуализации активации нейронов гиппокампа. Окрашенные срезы мозга показывают более темные области под светлопольным микроскопом, что указывает на активированные нейроны.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Иммуногистохимия

1. Перенесите 3-5 дорсальных участков гиппокампа для каждой мыши в 24 многолуночные планшеты, содержащие 500 μл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS) для каждой лунки.
2. Срезы, содержащиеся в каждой лунке, промыть 500 мкл 0,1 М PBS (5 мин, 3 раза с легким встряхиванием).
3. Погасите активность эндогенной пероксидазы путем инкубации секций в 1% перекиси водорода (H₂O₂) в PBS в течение 20 мин с легким перемешиванием.
4. Промойте секции в PBS 0,1 M с легким перемешиванием (3 x 5 мин).
5. Пермеабилизация тканей: инкубировать срезы в течение 5 мин в 0,2% Triton X-100 в PBS.
6. На описанных выше этапах (1.4; 1.5) создайте достаточный буфер блокировки (10% сыворотки козы и 0.1% Triton-X100 в PBS) на весь эксперимент (количество секций x 100 мкл x 3 шага).
7. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сыворотку того же вида, в котором было получено вторичное антитело (Ab) (конъюгированное с биотином).
8. Предотвратите неспецифическое связывание антитела путем инкубации срезов в блокирующем буфере (100 мкл/срез) в течение 1 ч при комнатной температуре (ОТ) с бережным перемешиванием.
9. Инкубируют срезы в первичной Ab-фосфорилированной внеклеточной сигнал-регулируемой киназе (pERK), разведенной в блокирующем буфере в течение ночи при 4 °C, с легким перемешиванием.
10. Промойте секции в PBS 0,1 M с легким перемешиванием (3 x 5 мин).
11. Инкубировать вторичным Ab, конъюгированным с биотином (1:250), разведенным в блокирующем буфере (так же, как используется на шаге 1.6), в течение 1 часа при RT с легким перемешиванием.
12. Готовьте реагент авидин-биотин комплекс (АВС) одновременно, так как авидин и биотин требуют не менее 30 минут при комнатной температуре до комплекса.
13. Приготовьте необходимый объем реагента ABC в соответствии с протоколом производителя.
14. Промойте секции в PBS 0,1 M с легким перемешиванием (3 x 5 мин).
15. Инкубировать секции в течение 45 мин при РТ с реагентом ABC.
16. Промойте секции в PBS 0,1 M с легким перемешиванием (3 x 5 мин).
17. Для приготовления рабочего раствора диаминобензидина (DAB) каждый этап с участием DAB должен быть выполнен в вытяжном шкафу, так как DAB является канцерогенным и тератогенным веществом.
18. Перенесите раствор DAB на новую пластину с помощью пластиковой переводной пипетки.
19. Поместите срезы в пластину, содержащую рабочий раствор DAB, и медленно поворачивайте пластину вручную, чтобы обеспечить максимальное воздействие на срезы.
20. Следите за реакцией DAB на микроскопе до тех пор, пока не разовьется адекватный сигнал (2-5 мин).
21. Остановите реакцию при желаемой интенсивности цвета, промыв ткань в 0,1 М PBS (3 x 5 мин).
22. С помощью отбеливателя обезвредите оставшийся раствор субстрата DAB в вытяжном шкафу на ночь и утилизируйте его в соответствии с лабораторными рекомендациями.
23. Монтируйте секции на предметные стекла с желатиновым покрытием, плавая их в PBS. Затем просушите их при комнатной температуре не менее 3-4 часов.
24. Последовательно обезвожьте секции в 50%, 70%, 95% и 100% этаноле в течение 2 минут каждая и очистите в 100% ксилоле в течение 5 минут.
25. Защитите створку с помощью монтажного носителя и оставьте в вытяжном шкафу для сушки на ночь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% этанол	Fisher Scientific	A406-20	Используется для создания градиента этанола для обезвоживания перед установкой на слайд.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - для использования под капотом. Меняйте ксилол каждый месяц в зависимости от использования.
PBS	Sigma	P3813-10PAK	<
Sigma	T-8787	<
Sigma	H1009-100ML
Обычная козья сыворотка	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Добавьте в объем 5 мл PBS 2 капли реагента А, перемешайте, а затем добавьте 2 капли реагента Б и перемешайте.
DAB peroxidasa substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Добавьте в объем 5 мл дважды дистиллированной воды: 2 капли буферного исходного раствора и смешать; 4 капли DAB и смешать; 2 капли перекиси водорода и смешать.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated goat anti-rabbit IgG антитела	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Карл Рот<	<
Fisher	12-548-B	<
Sigma	317616	Монтажная среда для слайдов. Можно использовать эквивалентную монтажную среду.

td style='height:14.5pt;width:148pt;'>Triton X-100td style='height:14.5pt;width:148pt;'>Перекись водородаtd style='width:169pt;'>1879td style='height:14.5pt;width:148pt;'>Coverslipstd style='height:29.0pt;width:148pt;'>DPX