Визуализация внутриклеточной динамики АТФ с помощью сенсоров на основе FRET в органотипическом срезе гиппокампа мыши

Аннотация

Источник: Lerchundi, R., et. al. Визуализация внутриклеточной АТФ в органотипических срезах тканей мозга мыши с помощью сенсора ATeam1.03YEMK на основе FRET. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует использование датчиков на основе FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) для измерения внутриклеточных уровней АТФ в органотипических срезах гиппокампа мышей, что позволяет визуализировать динамику АТФ в нейронах и астроцитах в режиме реального времени в физиологических и экспериментальных условиях.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Визуализация АТФ на основе FRET (Рисунок 1)

1. } Перед экспериментом приготовьте E-ACSF и добавьте в него 95% O₂/5% CO₂ в течение не менее 30 минут, чтобы получить pH 7,4. Включите источник флуоресцентного света (ксеноновую лампу) монохроматора (Рисунок 1). Запускайте перфузию непосредственно перед тем, как вынуть срез из инкубатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите физиологический раствор пузырчатым с 95% O₂ и 5% CO₂} в течение всего эксперимента.
2. Перенесите срез в экспериментальную камеру, которая постоянно перфузируется свежекарбогенированным E-ACSF с помощью перистальтического насоса (Рисунок 1). Затем зафиксируйте срез сеткой. Поместите камеру на предметный столик микроскопа и подключите систему перфузии. Для перфузии рекомендуется использовать газонепроницаемые лабораторные трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты могут проводиться при комнатной температуре или при температуре, близкой к физиологической, в зависимости от плана эксперимента. Проверьте стабильность и надежность перфузионного потока, чтобы избежать изменений фокуса, вызванных движением ткани и/или изменениями напряжения сдвига. Стандартные скорости перфузии для работы со срезами, используемые нами и многими другими лабораториями, составляют 1,5-2,5 мл/мин.
3. }Сфокусируйте культивированный срез с помощью просвечивающего света. Определите область, в которой будут проводиться эксперименты (например, область CA1 гиппокампа). Прежде чем начинать эксперименты с визуализацией, подождите не менее 15 минут, чтобы срезы адаптировались к солевым условиям. Конфигурацию экспериментальной установки см. на рисунке Рисунок 1.
4. Включите камеру и программное обеспечение для обработки изображений. Затем выберите подходящий куб фильтра.
5. Возбуждайте донорский флуоресцентный белок (eCFP) на длине волны 435/17 нм (~435 нм). Установите время экспозиции от 40 до 90 мс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное воздействие флуоресцентного света на срезы может привести к фототоксическим эффектам.
6. Возбуждение на длине волны 435 нм приводит к излучению как на длине волны 475 нм (eCFP; донор), так и на длине волны 527 нм (Венера; акцептор). Разделите флуоресцентное излучение на длине волны 500 нм с помощью разделителя изображения излучения и используйте полосовые фильтры на длинах 483/32 и 542/27 для дальнейшей изоляции донорной и акцепторной флуоресценции. Сильная экспрессия может привести к насыщению детекторов. В этом случае вы можете использовать фильтр нейтральной плотности для снижения интенсивности возбуждения.
7. Выберите область интереса (ROI), по-видимому, лишенную клеточной флуоресценции, для вычитания фона. Затем создайте ROI, описывающие тела клеток.
8. Установите частоту получения изображения и общее время записи. Для длительных (>30 мин) экспериментов рекомендуется использовать частоту регистрации 0,2-0,5 Гц для предотвращения фототоксичности.
9. Запустите запись. Рекомендуется записывать не менее 5 минут в исходных условиях, чтобы обеспечить стабильность препарата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте фокус ячейки во время записи.

Результаты

Рисунок 1: Конфигурация настройки образа FRET. (A) Схематическое изображение различных компонентов и их пространственного расположения, необходимых для установки визуализации FRET...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	Неметаболизируемый аналог
Фильтры полосового пропускания 483/32	AHF Analysentechnik AG		Совместимый с разделителем фильтр
Фильтры полосового пропускания 542/27	AHF Analysentechnik AG		Совместимый с разделителем фильтр излучения
Светоделитель T 455 LP	AHF Analysentechnik AG	<
Светоделитель T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG	<
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Научное программное обеспечение для
D-глюкоза моногидрат	Caelo	2580-1KG<
GIBCO/Life	14190250	Фосфатно-солевой буфер
Eclipse E 600FN вертикальный микроскоп	Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 вертикальный микроскоп	Nikon Microscope Solutions
Экспериментальная камера	custom build		Перфузионная камера для визуализации
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	С феноловым красным для мониторинга
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media
Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ультрабыстрый switching monochromator
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Water Immersion Microscope Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions		Программное обеспечение для обработки изображений. Обновленная версия для создания образа
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Digital CMOS camera
Perfusion tubing	Pro Liquid GmbH		трубка Tygon, 1.52 x 322 мм (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0	Adobe		Image processing software
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Одноцепочечный вектор AAV, который индуцирует экспрессию ATeam1.03YEMK под контролем фрагмента промотора 1 синапсина человека hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Одноцепочечный вектор AAV, который индуцирует экспрессию ATeam1.03YEMK под контролем фрагмента промотора глиального фибриллярного кислого белка человека ABC1D.

глюкозы. излученияtd style='width:318pt;'>Возбуждение дихроичного зеркалаtd style='width:318pt;'>Splitter dichroic построения графиков и анализа данныхtd style='width:318pt;'> <td style='height:14.5pt;width:204pt;'>DPBS Dulbecco живых клеток pH на ладах