В этом видео демонстрируется техника визуализации сетчатки in vivo с помощью двухфотонной микроскопии. Мышей под наркозом готовят к визуализации, фиксируя их голову, нанося глазную смазку и накладывая на глаз покровное стекло. Ганглиозные клетки сетчатки (ГСК), экспрессирующие флуоресцентные белки, сначала визуализируются с помощью эпифлуоресценции для выравнивания. Наконец, используется двухфотонная визуализация, позволяющая визуализировать RGC с высоким разрешением.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Двухфотонная визуализация сетчатки мышей in vivo
1.8K просмотров
⸱
28 апреля 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мыши к получению изображения
- }
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить воздействие изофлурана, обеспечьте надлежащую очистку отработанных газов. Убедитесь, что выпускное отверстие индукционной камеры дл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Позиционирование мышей для визуализации in vivo. Чтобы расположить мышь зрачком на оси со световым путем, мышь под наркозом сначала удерживают в держателе для головы, голову поворачивают и наклоняют, на глаз кладут крупную каплю лубрикантного геля для глаз, и мышь кладут на сцену. Покровное стекло устанавливается в держатель покровного ст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 мм x 40 мм |
| 50 мл стеклянный шприц | Hamilton | 80950 | 22G цементированная игла |
| Дыхательный воздушный насос | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | Для решения для |
| Базовое устройство для анестезии мелких животных | RWD Life Science | R500IE | |
| Капилляр из боросиликатного стекла | Sutter | B150-86-10 | Наружный диаметр 1,50 мм, внутренний диаметр 0,86 мм, длина 10 см |
| CFP/YFP фильтрующий куб | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Двухканальный детектирующий блок ФЭУ | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Циркуляционный тепловой насос | Braintree Scientific | tp-700 | установлен на 37 °C |
| Пищевая пленка | VWR | 10713-916 | |
| Компактный держатель фильтра | ThorLabs | DH1 | Удерживает покровное стекло над мышиным глазом |
| Cx3cr1-GFP трансгенные мыши (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | Лаборатория Джексона | 5582 | |
| Шасси контроллера сбора данных | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Устройство сбора данных | National Instruments | BNC-2090A | |
| модуль FPGA с дигитайзером | National Instruments | NI-5734 | |
| Аппарат для эвакуации газа | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe гель-смазка для глаз | Alcon | (из местной аптеки) | Для использования во время визуализации |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Грелка | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics для использования с Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Бесплатное программное обеспечение | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Канистра с газовым фильтром изофлурана (активная продувка) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Канистра с газовым фильтром изофлурана (пассивная очистка) | RWD Life Science | R510-31S | |
| кетамин гидрохлорид (100 мг/мл) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 на M26 адаптер | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software MathWorks | NA | R2015b | |
| meloxicam (5 мг/мл) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Минеральное масло | Fisher | BP2629-1 | |
| Мини-бульдожий гемостатический зажим | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Миниатюрная трубка EVA 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Миниатюрная трубка EVA 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Держатель для головы мыши | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Щипцы | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Оптические стойки 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Комплект измерителя оптической мощности | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | Для раствора |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | Для иммобилизации |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Вращающийся 1/2" стоечный зажим | ThorLabs | SWC | |
| пакет ScanImage | Vidrio Technologies | Freeware | Программное обеспечение для получения изображений; Версия 5.4.0 (2018); требуется MATLAB |
| раствор хлорида натрия, стерильный (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Стереомикроскоп | Leica S9 | E | |
| Настольная центрифуга | Oxford | Benchmate C8 | |
| Террамицин окситетрациклин/полимиксин B антибиотик офтальмологическая мазь | Zoetisus | NA | Для использования после интравитреального инъекционного введения |
| Система охлаждения ThermoRack | Твердотельные системы охлаждения | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre трансгенные мыши (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | Лаборатория Джексона | 16962 | |
| VGlut2-Cre трансгенные мыши (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 16963 | |
| VivoScope for In vivo | Imaging Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| Белая смазка для глаз с петролатум-минеральным маслом | Stye | NA | For использование после визуализации |
| xylazine HCl (20 мг/мл) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
