Флуоресцентная визуализация нейроиммунной динамики с использованием имплантата черепа

Аннотация

Источник: Бишт, К., et al. Точное картирование мозга для выполнения повторяющейся визуализации нейроиммунной динамики у мышей in vivo. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует флуоресцентную визуализацию нейроиммунной динамики у трансгенной мыши с имплантатом черепа. Стабильность сосудов и нейронов визуализируется наряду с динамическими изменениями микроглии, отражающими иммунные реакции на активность нейронов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка мышей к имплантации черепных окон

ПРИМЕЧАНИЕ: Различные трансгенные линии мышей с флуоресцентными метками подходят для визуализации.

1. Используйте мышей CX3CR1GFP/+ для визуализации микроглии in vivo. Как правило, используются молодые и молодые взрослые мыши в возрасте от 4 до 10 недель весом от 17 до 25 г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот подход подходит даже для мышей до отлучения от груди, необходимость возвращать мышей в клетки с их матерями для кормления может усложнить восстановление, если мать не будет должным образом заботиться о детенышах после операции. Поэтому рекомендуется использовать мышей после отъема.
2. Обезболите мышь с помощью изофлурана (5% поток кислорода для индукции в течение 1 мин) в анестезиологической камере. Убедитесь, что мышь не проявляет никаких движений или подергиваний на щипки пальцев ног и/или хвоста. Выньте мышь из камеры и на открытом воздухе тщательно сбрейте волосы на голове между ушами примерно от уровня глаз до верхней части шеи с помощью триммера для волос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая концентрация изофлурана будет зависеть от размера индукционной камеры. Поэтому для небольших камер можно использовать 3-4% изофлуран для эффективного индуцирования анестезии, в то время как для больших камер потребуется до 5%.
3. Переместите мышь к носовому конусу станции стереотаксической хирургии для анестезии (1,5-2% для поддержания во время операции), стабилизируйте ее голову с помощью ушных вкладышей и держите мышь на грелке, чтобы поддерживать температуру ее тела в тепле.
4. Смажьте оба глаза глазной мазью. Введите 100 мкл 0,25% бупивакаина (для обеспечения местной анальгезии мыши в течение 8-12 часов) и 100 мкл 4 мг/мл дексаметазона (для уменьшения воспаления, которое может возникнуть в результате хирургической процедуры) подкожно в место разреза. Дайте мыши постоять не менее 5 минут, прежде чем переходить к следующему шагу.
5. Очистите бритую голову тремя чередующимися тампонами с бетадином и 70% спиртом. С помощью хирургического лезвия или ножниц сделайте разрез по средней линии кожи головы, простирающийся от задней части черепной области между ушами до лобной области между глазами. Оставшаяся кожа разрезается, чтобы обнажить череп.
6. Очистите соединительную ткань, расположенную между кожей головы и подлежащим черепом, 3% перекисью водорода (H{{}}₂O₂) и локализуйте область мозга, которую нужно изобразить, со стереотаксическими координатами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто возникает кровотечение (шаг 1.5) из разреза на поверхности черепа. Это кровотечение обычно проходит само по себе в течение 3-5 минут. Помогает чистка перекисью. Также отмечается, что предшествующее лечение бупивакаином (шаг 1.4) ограничивает количество кровотечений в течение этого времени.

2. Операция по имплантации черепного окна мыши

1. Просверлите круглое отверстие ~4 мм в черепе с помощью зубного сверла (диаметр наконечника 0,7 мм) и осторожно удалите эту часть черепа с помощью заостренных щипцов. Для визуализации соматосенсорной коры 6-8-недельных мышей расположите центр трепанации черепа на -2,5 сзади и ± 2,0 латерально от брегмы. Во время бурения регулярно увлажняйте череп стерильным физиологическим раствором и ватными тампонами, чтобы охладить мозг, очистить костный мусор и размягчить кость черепа для возможного удаления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты для трепанации черепа будут варьироваться в зависимости от интересующего региона и возраста мышей.
2. После удаления черепа осторожно поместите в трепанацию черепа небольшое покровное стекло (размер #0 при толщине 0,1 ± 0,02 мм), смоченное физиологическим раствором. Высушите излишки физраствора с помощью стерильной салфетки.
3. С помощью заостренного аппликатора (например, наконечника пипетки или заостренного конца сломанной деревянной ватной палочки) нанесите цианоакрилатный клей вокруг окна и дайте ему прикрепиться к мозгу и черепу. Нанесите грунтовочный клей на остальную часть черепа и просушите его с помощью полимеризующей лампы в течение 20-40 с. Подготовьте лунку вокруг окна с помощью окончательного клея и отверждайте с помощью отверждающего света 20-40 с.
4. Приклейте небольшую головную пластину к черепу на контралатеральной полусфере краниотомии сначала с помощью грунтовочного клея в качестве грунтовки, а затем с помощью последнего клея. Отверждайте оба света в течение 20-40 секунд каждое.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Швы не нужны, если череп покрыт клеем во время этой процедуры.

3. Послеоперационный уход

1. Дайте мышке проснуться без анестезии (восстановление, проведенное на грелке, сокращает время восстановления) и верните ее в домашнюю клетку, когда полностью проснутся. Введите одну подкожную дозу бупренорфина SR (0,5 мг/кг) в качестве послеоперационной анальгезии, достаточной в течение 72 ч.
2. Чтобы способствовать здоровому восстановлению после операции, обеспечьте мышь очень мягкой пищей, такой как обычная твердая пища, замоченная в воде, чтобы размягчить ее, или пища в виде геля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно однократного приема мягкой пищи сразу после операции.
3. Ежедневно следите за здоровьем мыши и правильным восстановлением в течение первых 72 часов после хирургической процедуры. После этого уже через 2 недели будет проведена операция по имплантации через окно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если все сделано правильно, мыши хорошо восстанавливаются, демонстрируя нормальное передвижение, достаточное исследование клетки, хорошую гидратацию, стабильный набор веса и обширное взаимодействие с другими мышами в клетке и другими предметами в клетке. Мышей, у которых наблюдалась вялость, обезвоживание и потеря веса более чем на 10% после операции, усыпляли и удаляли из исследования.

4. Двухфотонное картирование мозга для первичной визуализации

1. Обезболивание мыши (изофлуран, 5% индукция и 1,5% поддержание). Стабилизируйте головку с помощью винтов для крепления головной пластины на предметном столике двухфотонного микроскопа, удерживая ее на нагревательной пластине при температуре 35 °C. Введите внутрибрюшинно 100 мкл красителя для кровеносных сосудов, такого как родамин B (2 мг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация также может быть сделана на бодрствующих мышах без анестезии. Однако последние исследования показывают, что анестезия влияет на динамику микроглиального надзора. Фиксация головы для двухфотонной визуализации у бодрствующих мышей увеличивает стресс даже во время хронической визуализации в течение как минимум 25 дней.
2. Аккуратно очистите поверхность черепного окна ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле. Нанесите несколько капель воды или физиологического раствора на черепное окно и опустите линзу объектива в раствор, так как объектив является иммерсионной.
3. Нарисуйте от руки грубую карту, чтобы обозначить основные ориентиры кровеносных сосудов в лабораторном блокноте, глядя в окуляр с помощью эпифлуоресценции. Используйте этот рисунок для идентификации конкретных областей во время двухфотонной визуализации. В качестве альтернативы можно сделать снимки кровеносных сосудов либо с помощью камеры, установленной на микроскопе, либо с помощью ручной камеры или телефона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти нарисованные от руки изображения и картинки предназначены для облегчения повторного посещения одних и тех же широких областей под микроскопом перед двухфотонной визуализацией. Это не точное сопоставление изображений.
4. С помощью двухфотонной визуализации при необходимости соберите изображения флуоресцентных клеток и сосудов. Делайте тщательные заметки с соответствующими координатами, чтобы убедиться, что точные регионы могут быть повторно посещены для последующей визуализации. Соберите несколько полей зрения во время этого первого сеанса визуализации, например, получайте изображения z-стека каждые 1-2 мкм через объем ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе изображений с помощью двух фотонов, ориентиры кровеносных сосудов используются для грубого картографирования. Если необходимо точное картирование, используют меченые YFP дендриты от мышей Thy1-YFP.
   1. Используйте эти рекомендуемые параметры для визуализации: длина волны 880-900 нм является оптимальной; для возбуждения GFP и/или dsRed/Rhodamine используется дихроичное зеркало с длиной волны 565 нм с эмиссионными фильтрами 525/50 нм (зеленый канал) и 620/60 нм (красный канал); для разделения GFP и YFP используется дихроичное зеркало с длиной волны 509 нм с эмиссионными фильтрами 500/15 и 537/26 нм; мощность мозга поддерживается на уровне 25 мВт или ниже; разрешение изображения составляет 1024 x 1024 пикселей, поле зрения, снятое с объективом 25X 0.9 NA с коэффициентом масштабирования 1.5X составляет 295.24 x 295.24 μм.
5. В конце визуализации снимите мышь со сцены, дайте ей проснуться от анестезии и вернитесь в свою домашнюю клетку до следующего сеанса визуализации.

5. Двухфотонная визуализация и повторная визуализация

1. Для будущих последующих сеансов визуализации, которые могут занять от нескольких часов до нескольких месяцев после первого сеанса визуализации, обезболите мышь (изофлуран, 5% индукция и 1,5% поддерживающая терапия), установите на двухфотонный микроскоп, держите на нагревательной пластине и повторно введите 100 мкл красителя кровеносных сосудов, такого как родамин B (2 мг/мл).
2. Откройте ранее полученные изображения в ImageJ и, используя эти изображения, а также заметки из предыдущего сеанса, определите ранее изображенные области и тщательно повторите их изображение.
3. Повторяйте это до тех пор, пока окно визуализации не будет прозрачным или не будет иметь существенного значения для объема исследования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Цианоакрилатный клей (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1	<
Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Сверло	Fine Science Tools	#19008-07	<
Henry Schien	1338333	<
Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)	<
Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

td style='height:14.5pt;width:200pt;'>Dental Drilltd style='height:14.5pt;width:200pt;'>Eye Ointmenttd style='height:14.5pt;width:200pt;'>iBond Total Etch (Primer glue)td style='height:14.5pt;width:200pt;'>Tetris Evoflow glue (Final glue)