Флуоресцентная визуализация динамики кальция в нервно-мышечных соединениях диафрагмы трансгенной мыши

Аннотация

Источник: Heredia, D. J., et. al.al ex vivo визуализация клеточно-специфической передачи сигналов кальция в трехстороннем синапсе диафрагмы мыши. J. Vis. Exp. (2018)
}

Это видео демонстрирует флуоресцентную визуализацию динамики кальция в нервно-мышечных соединениях (НМЖ) у трансгенной мыши, экспрессирующей генетически кодируемые показатели кальция. NJM идентифицируется флуоресцентно помеченными ацетилхолиновыми рецепторами в диафрагме с диафрагмальным нервом. Разветвитель изображения используется для одновременной визуализации нескольких сигналов. Подается электрический стимул, и регистрируется изменение флуоресценции в NMJ в ответ на приток кальция.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

TAG_11{{}}}1. Препарирование диафрагм и диафрагмальных нервов у трансгенных мышей

1. Приобретите трансгенных мышей и олигонуклеотидные праймеры для генотипирования этих мышей.
   1. Скрестите мышь в возрасте от 3 до 6 месяцев, экспрессирующую одну копию соответствующего трансгенного/нокаут-ин аллеля Cre-driver и ноль копий условного аллеля GCaMP3/6, со второй мышью того же возраста, экспрессирующей одну или две копии условного аллеля GCaMP3/6 и ноль копий аллеля Cre-driver.
   2. Генотипируйте детенышей и пометьте их как Cre, так и условными аллелями GCaMP3/6 — в дальнейшем они будут называться двойными трансгенными мышами (например, Myf5-Cre, условный GCaMP3).
      Примечание: Таким образом, все данные будут получены от мышей, экспрессирующих одну копию как Cre, так и условных аллелей GCaMP3/6. Это особенно важно при добавлении других мутантных мышей (например, нокаутов) к этим скрещиваниям.
2. Когда мыши с двойным трансгеном достигают соответствующего возраста (например, на 0-й или 5-й день после рождения [P0 или P5] или взрослой особи), усыпляют мышей, обезглавливая их ножницами (для мышей моложе P10) или помещая их в ингаляционную камеру с изофлураном. Когда они перестают реагировать на ущипывание хвоста парой щипцов, они готовы к жертвам.
3. Принесите животное в жертву, обезглавив его ножницами.
4. Поперечный разрез по всему животному чуть ниже печени и чуть выше сердца и легких ножницами для иридэктомии.
5. Рассеките печень, сердце и легкие, стараясь поддерживать длину диафрагмального нерва, достаточную для того, чтобы его можно было втянуть в отсасывающий электрод (т.е. 1-2 см).
   Примечание: Левый диафрагмальный нерв может быть идентифицирован как белый кусок ткани, который входит в медиальную часть левой диафрагмы. Его нельзя резать при удалении легких. Правый диафрагмальный нерв проходит внутри части фасции, которая также содержит верхнюю полую вену и является тоньше и белее, чем полая вена. Вместе они оба проникают в правую медиальную диафрагму.
6. Далее удаляют грудную клетку и позвоночный столб, кроме тонкого гребня вокруг диафрагмы.
7. Поместите диафрагму и образец диафрагмального нерва в микрофужную пробирку с раствором Кребса-Рингера с концентрацией 1 мкг/мл 594-αBTX на 10 минут в темноте.
   Примечание: Эта концентрация 594-αBTX маркирует ацетилхолиновые рецепторы (AChR), не блокируя их функцию (личное наблюдение).

2. Стимуляция и регистрация потенциалов мышечного действия

1. С помощью мельчайших штифтов обездвижите диафрагму, прикрепив ее к 6-сантиметровой чашке, покрытой силиконовым диэлектрическим гелем и заполненной ~8 мл насыщенного кислородом раствора Кребса-Рингера, и поместите ее на предметный столик микроскопа. Перфузируйте диафрагму большим количеством раствора Кребса-Рингера (8 мл/мин) в течение 30 мин.
   Примечание: Это промывает несвязанный 594-αBTX, а также уравновешивает ткань после рассечения.
2. Изготовьте отсасывающий электрод по установленным методикам.
   1. При 4-кратном увеличении, используя микроманипулятор, переместите аспиратор над левым диафрагмальным нервом и примените отсасывание, вытащив цилиндр шприца объемом 5 мл, подключенного к трубке, прикрепленной к отсасывающему электроду.
      Примечание: При успешном втягивании в всасывающий электрод диафрагмальный нерв натягивается. Включите стимулятор и стимулируйте диафрагмальный нерв, щелкнув ручным переключателем 1 раза.
   2. Убедитесь, что диафрагма сокращается в ответ на стимуляцию 1 Гц, визуально рассмотрев ее с помощью светового освещения. Если нет, отрегулируйте напряжение, поворачивая ручку напряжения постепенно, чтобы получить сверхмаксимальный импульс, который можно проверить визуальным осмотром сокращения мышц. Если нерв по-прежнему не виден, продуйте нерв шприцем и попытайтесь втянуть его снова, применяя отсасывание.
3. Выключите перфузию и добавьте специфичный для мышц ингибитор миозина BHC6 или потенциал-зависимый антагонист натриевого канала μ-конотоксин8 до конечной концентрации 100 мкМ.
   1. Чтобы получить 100 мкМ BHC, пипетка 4 мкл 200 мМ запаса в ДМСО и разведите его в 1 мл раствора Кребса-Рингера.
   2. Достаньте из посуды 1 мл раствора Krebs-Ringer.
   3. Добавьте в блюдо предварительно разведенный BHC.
      Примечание: Это предварительное разведение помогает предотвратить индукцию неразбавленным ДМСО непереходного флуоресцентного ответа в клетках, экспрессирующих GCaMP3.
   4. Подождите 30 минут, а затем включите перфузию свежего раствора Кребса-Рингера еще на 20 - 30 минут.
4. Подготовьте записывающий электрод.
   1. Надев перчатки, поместите боросиликатное стекло с наружным диаметром (OD) 1 мм и внутренним диаметром (ID) 0,4 мм в съемник микропипетки, затяните диски, чтобы зафиксировать его на месте, и закройте дверцу съемника.
   2. Используя съемник P-97, запрограммируйте следующие настройки: нагрев на 900, тяга на 120, скорость на 75, время на 250, давление на 500 и никаких дополнительных петель.
      Примечание: Сопротивление (R) измеряется с помощью программного управления усилителем: программное обеспечение для сбора данных подтверждает сопротивление, решая формулу V = IR. Программный контроллер пропускает известный ток (I) (обычно 1 нА) через электрод и измеряет изменение напряжения (В), что позволяет нам решить проблему R.
   3. Для эмбриональных диафрагм убедитесь, что сопротивление составляет около 60 МОм, а для более старых диафрагм 10 - 20 МОм. Нагрузите записывающий электрод 3 М хлорида позатия (KCl).
5. При 10-кратном увеличении опустите электрод в мышцу, используя второй микроманипулятор на противоположной стороне сцены в качестве стимулирующего электрода.
6. Используя программное обеспечение для сбора электрофизиологических данных, подождите, пока потенциал мембраны покоя изменится от 0 до -65 мВ или ниже.
7. Стимулируйте на частоте 1 Гц и проверьте наличие потенциала мышечной активности, проверив наличие большого потенциала, который демонстрирует небольшой выброс (потенциал, который поднимается выше 0 мВ, когда он начинается с -65 мВ или ниже). Не стоит путать артефакт стимуляции с потенциалом действия.
   Примечание: Потенциалы значительно дольше по длительности (~5 мс), чем артефакты стимуляции.

3. Визуализация флуоресценции образца

1. }При 20-кратном увеличении найдите полосу концевой пластины в центре мышцы, ища 594-αBTX-меченые нервно-мышечные соединения или NMJ при возбуждении зеленым/желтым светом (550 нм). Переключитесь на возбуждение синим светом (470 нм) для получения изображения реакций Ca²⁺} в мышечных, моторных нейронах или шванновских клетках.
2. При желании настройте разделитель изображения с полосовыми фильтрами и дихроичным однокраевым фильтром для визуализации с двумя длинами волн.
3. Чтобы рассчитать максимальную флуоресценцию (Fmax), проявляемую тканью, экспрессирующей GCaMP3/6, добавьте 12 мкл 3 М хлорида калия (KCl) в препараты диафрагмы.
   1. Проводите эксперименты с полосой яркости на панели таблицы поиска, установленной на 110% от уровня, при котором ткань, экспрессирующая GCaMP3/6, демонстрирует насыщение при 20-кратном увеличении без биннинга в ответ на KCl.
4. Записывайте со скоростью 20 кадров в секунду, чтобы не пропустить ни одного быстрого события.
5. Стимулируйте 1 - 45 с 20 - 40 Гц стимуляции нервов путем подачи серии импульсов с помощью аспираторного электрода или добавьте фармакологические агонисты путем применения ванны или перфузии и соберите динамические флуоресцентные ответы Ca²⁺ ответы в одном подтипе клеток вместе со статическим сигналом 594-αBTX NMJ.
   Примечание: Если тканеспецифичные красные или дально-красные индикаторы кальция (GECI) или генетически кодируемые индикаторы напряжения (GEVI) становятся доступными для использования в NMJ, они могут быть использованы для сбора двух динамических сигналов, отражающих два различных клеточных элемента в NMJ.
6. Когда визуализация или электрофизиологические эксперименты завершены и желаемые результаты были достигнуты, перфузируйте воду через перфузионные линии и всасывайте воду в 2-3 раза через всасывающий электрод, чтобы гарантировать, что соли не накапливаются.

Материалы