Двухцветная визуализация вынужденного комбинационного рассеяния мышиной ткани

Аннотация

Источник: Эспиноза, Р., и др. Двухцветная визуализация комбинационного рассеяния света мыши в реальном времени для диагностики тканей. J. Vis. exp. (2022).

Видео демонстрирует двухцветную визуализацию срезов мозговой ткани мышей методом вынужденного комбинационного рассеяния света (SRS). Два синхронизированных лазерных луча направляются на участок ткани для возбуждения молекулярных колебаний, что приводит к изменению относительной интенсивности лучей. Липиды и белки в ткани обнаруживаются с помощью различных частотных пар лазерных лучей. Полученным сигналам затем присваиваются отдельные цвета, создавая двухцветное изображение, которое помогает идентифицировать белки и липиды в ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Обнаружение сигнала SRS

1. }Электрооптическая модуляция (ЭОМ)
   ПРИМЕЧАНИЕ:} ЭОМ 20 МГц используется для модуляции амплитуды Стокса. Как будет рассмотрено ниже, EOM является производной от последовательности лазерных импульсов с частотой 80 МГц, которая необходима для ортогональной модуляции. Другие частоты модуляции могут быть использованы, если выполняется только одноцветная или гиперспектральная SRS. В этом случае нет необходимости в синхронизации частоты модуляции с частотой лазера. Генератор частоты с радиочастотным (РЧ) усилителем мощности может использоваться для управления ЭОМ. В результате шаги 1.1.1-1.1.4 можно пропустить.
   1. Поместите дискретизатор пучка на пути пучка Стокса, чтобы захватить 10% луча и направить его на быстрый фотодиод для обнаружения последовательности импульсов на частоте 80 МГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал фотодиода отправляется на делитель частоты для генерации выхода TTL 20 МГц. Этот выход далее отправляется в буфер разветвления для репликации вывода на четыре идентичных выхода 20 МГц. Один из выходов используется для запуска осциллографа.
   2. Возьмите один из выходов разветвленного буфера и отфильтруйте его с помощью полосового фильтра, чтобы получить синусоидальную волну с частотой 20 МГц. Используйте радиочастотный аттенюатор для регулировки выходного размаха напряжения до ~500 мВ.
   3. Передайте полученный выход на фазовращатель, который позволяет точно регулировать фазу РЧ с помощью источника напряжения. Отправьте этот выход на радиочастотный усилитель мощности и подключите выход усилителя к EOM.
   4. Разблокируйте луч Стокса и оптимизируйте глубину модуляции EOM1, разместив фотодиод на пути луча. Отрегулируйте напряжение EOM и четвертьволновую пластину до тех пор, пока глубина модуляции (отношение долины к пику) не станет удовлетворительной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При модуляции 20 МГц (1/4 частоты повторения лазера) ожидается два импульса каждые 50 нс.
2. Временное перекрытие
   ПРИМЕЧАНИЕ: Временное перекрытие накачки и Стокса достигается за счет задержки одной из двух последовательностей лазерных импульсов с помощью ретрорефлектора, установленного на ступени задержки (Рисунок 1 показывает задержку Стокса). Грубое перекрытие контролируется с помощью осциллографа, а мелкое перекрытие контролируется сигналом SRS. Тонкое временное перекрытие также может быть достигнуто с помощью автокоррелятора, если таковой имеется.
   1. Поместите фотодиод после дихроичного зеркала, чтобы обнаружить лазерный луч. Сначала заблокируйте луч Стокса. Увеличьте масштаб одного из пиков импульсов накачки на осциллографе. Поместите вертикальный курсор, чтобы отметить временное положение этого пика с помощью осциллографа.
   2. Заблокируйте луч насоса и разблокируйте луч Стокса. Преобразуйте каскад задержки так, чтобы пиковое положение на осциллографе по времени совпало с отмеченным положением на предыдущем шаге. Смотрите Рисунок 2} для отображения временного перекрытия двух лучей.
      1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Если перемещение ступени задержки недостаточно для временного согласования двух лучей, переместите ступень задержки в середину диапазона ее перемещения.
      2. Рассчитайте расстояние задержки, необходимое для согласования двух лучей, взяв временную разницу между двумя лучами и умножив разницу на скорость света, чтобы найти расстояние, необходимое для временного согласования двух лучей.
      3. Удлините траекторию луча более быстрого луча или укоротите траекторию луча более медленного луча, чтобы примерно соответствовать временной задержке соответственно.
   3. Подготовьте образец предметного стекла микроскопа с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) и двустороннего скотча в качестве прокладки для удержания образца между предметным стеклом и покровным стеклом.
   4. Поместите образец на микроскоп стороной покровного стекла к объективу микроскопа. Переключите микроскоп на светлопольное освещение и наблюдайте за образцом из окуляра. Найдите фокус образца, сначала найдя фокус на верхнем и нижнем слое пузырьков воздуха на границе стекло-лента, а затем переместите фокус так, чтобы он оказался между двумя слоями ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лазерные лучи заблокированы, прежде чем смотреть в окуляр.
   5. Установите перестраиваемый выход луча на 798 нм. В зависимости от оптической пропускной способности конденсатора отрегулируйте оптическую мощность на уровне ~40 мВт для насоса и лучей Стокса в фокусе объектива.
   6. Откройте ScanImage в MATLAB (или другом программном обеспечении для сканирования, которое управляет микроскопом) и нажмите на кнопку с надписью FOCUS ), чтобы начать сканирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерные лучи будут сканироваться растром через образец для создания изображения. Низкочастотный сигнал, выходной сигнал от фотодиода (<100 кГц) направляется непосредственно в канал 1 карты сбора данных (называемый каналом постоянного тока). Высокочастотный выход (>100 кГц) от фотодиода направляется в синхронный усилитель, а X-выход сигнала синхронного усилителя направляется в канал 2 платы сбора данных (называемый каналом переменного тока).
   7. Отрегулируйте рулевое зеркало перед гальваническим сканером, чтобы он центрировал сигнал постоянного тока на дисплее канала 1. Переместите моторизованный каскад задержки и внимательно посмотрите на выход блокировки, отображаемый на дисплее канала 2 (т. е. канала переменного тока).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда насос и Стокса совпадают по времени, сигнал появится на канале переменного тока. Полезно настроить цветовую шкалу канала переменного тока, чтобы отобразить небольшое изменение интенсивности.
   8. Увеличьте интенсивность сигнала переменного тока, точно регулируя временную задержку. Отрегулируйте дихроичное зеркало так, чтобы он центрировал сигнал SRS по каналу переменного тока (при этом канал постоянного тока был центрирован). Отрегулируйте фазу синхронного усилителя, чтобы максимизировать сигнал. Смотрите Рисунок 3 для удовлетворительного сигнала.

3. Оптимизация спектрального разрешения

ПРИМЕЧАНИЕ:{{}} Накачка и пучки Стокса, достигающие образца, должны иметь одинаковую величину групповой дисперсии задержки (GDD) для максимизации спектрального разрешения. Дисперсия сильно зависит от экспериментальной установки. В описанной здесь экспериментальной установке используются фемтосекундные импульсы с длиной волны 1040 нм и 800 нм в качестве импульсов Стокса и накачки соответственно. В качестве импульсно-растягивающей среды используются плотные кремневые стеклянные стержни (H-ZF52A).

1. Вставьте 48 см высокодисперсионного стеклянного стержня (H-ZF52A или эквивалентное плотное кремневое стекло) в траекторию луча 800 нм. Оцените GDD с помощью Eq (1):

   

   ПРИМЕЧАНИЕ:{{}}} GVD различных материалов стекла на разных длинах волн можно найти в ресурсе базы данных показателя преломления. Например, H-ZF52A имеет GVD 220.40 fs²/мм при 800 нм. Общий GDD составляет 105792 fs².

2. Рассчитайте, сколько см дисперсионного стеклянного стержня требуется добавить к тракту луча 1 040 нм, чтобы он соответствовал GDD насоса. Вставьте стержни дисперсионного стекла соответствующей длины в траекторию луча 1 040 нм, чтобы примерно соответствовать GDD луча 800 нм. Обратите внимание, что добавление стеклянных стержней изменит временное перекрытие двух лучей, и может потребоваться регулировка задержки.
3. Калибровка спектрального разрешения
   1. Сделайте образец предметного стекла микроскопа с помощью ДМСО. Поместите предметное стекло на микроскоп и проверьте мощность лучей, выходящих из конденсатора микроскопа. Отрегулируйте мощность соответствующим образом, чтобы иметь ~40 мВт каждый в фокусе образца.
   2. Откройте ScanImage из MATLAB. Найдите максимальный сигнал SRS, просканировав каскад задержки, который соответствует 2,913 см^-1 Рамановского пика ДМСО. Оценка положения предметного столика на основе предыдущего положения предметного столика с увеличенной длиной оптического пути из-за вставки стержней. Выравнивание пространственного перекрытия луча из-за небольшого отклонения луча при добавлении стеклянных стержней.
   3. Сохраните гиперспектральное сканирование SRS, последовательно делая серию изображений SRS во время перемещения моторизованного столика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон сканирования с задержкой охватывает два пика комбинационного рассеяния, соответствующие 2,913 см^-1 и 2,994 см^-1 Рамановские пики ДМСО соответственно. Эти два перехода наблюдаются при использовании накачки с длиной волны 800 нм и лазера Стокса с длиной волны 1040 нм.
   4. Построение графиков спектров SRS решения DMSO с помощью ImageJ или MATLAB. Подгоните большой пик DMSO 2,913 см^-1 к гауссовской или лоренцовой функции в MATLAB, чтобы рассчитать полную ширину в половине максимума (FWHM) пика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты показаны в Рисунок 4. Если присутствует только один широкий пик, это означает, что либо спектральное разрешение слишком низкое, чтобы различить два пика, и требуется больше стеклянных стержней, либо сканируемый диапазон был слишком мал для обнаружения второго пика. Как правило, приемлемое спектральное разрешение ДМСО составляет ~20-25 см^-1 при использовании стеклянного стержня длиной >60 см. Более низкое разрешение часто используется для визуализации тканей в обмен на более высокие сигналы с более короткими импульсами.
4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Используйте автокоррелятор или FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) для определения длительности импульса каждого плеча, чтобы точно рассчитать количество GDD и длину стержней, необходимых для согласования GDD между насосом и Стоксом.
5. Повторите шаги 3.3.2-3.3.4 для различных длин стержней на пучке Стокса, чтобы найти оптимальное спектральное разрешение, что означает, что наилучшее совпадение GDD было найдено экспериментально. Используйте несколько наборов стеклянных стержней, различающихся по длине, для достижения оптимального спектрального разрешения.

4. Определение характеристик сигнал/шум (SNR)

1. Убедитесь, что шаг 4.2 выполняется после полного пространственного и временного выравнивания.
2. Получите изображение SRS, соответствующее 2 913 см^-1 Рамановского пика ДМСО. Откройте изображение в программе ImageJ и выделите небольшую область в центре кадра. Используйте функцию measure ) для вычисления среднего значения и стандартного отклонения значений в выбранной области.

3. Разделите среднее значение выбранной области на стандартное отклонение, чтобы найти значение SNR, как в уравнении (2).

   

   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее отношение сигнал/шум для системы (с постоянной времени захвата 4 мкс) при использовании ДМСО при 40 мВт/40 мВт в фокусе для обоих плеч составляет >800. Более низкие концентрации ДМСО или более низкая мощность могут быть использованы для более точной оценки отношения сигнал/шум, если карта сбора данных имеет ограниченную битовую глубину.

4. Если отношение сигнал/шум слишком низкое, перенастройте лазерные импульсы для оптимизации пространственного перекрытия, временного перекрытия, согласования размера луча/коллимации и/или согласования дисперсии. Для объектива с кольцом коррекции аберраций оптимизируйте сигнал, отрегулировав кольцо коррекции.

5. Калибровка частотной оси

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для привязки положения ступени задержки к отсканированному переходу комбинационного рассеяния. Тщательный отбор растворителей необходим для создания подходящей «рамановской линейки». ДМСО является эффективным растворителем для CH-связей, так как он имеет два резких комбинационных пика на 2 913 см^-1 и 2 994 см^-1.

1. Сохраните гиперспектральное сканирование с диапазоном стадий задержки, охватывающим 2 913 см^-1 и 2 994 см^-1 Рамановские пики ДМСО. Сохраните позиции рабочей области, соответствующие гиперспектральному набору данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глобальный максимальный пик спектра соответствует DMSO 2,913 см^-1} Рамановское смещение и второй максимальный пик соответствует DMSO 2,994 см^-1 Рамановское смещение.
2. Выполните линейную регрессию для положения сцены и сдвиг комбинационного рассеяния на 2 913 см^-1 и 2 994 см^-1. Используя уравнение линейной регрессии, связывающее положение ступени с рамановским сдвигом, преобразуйте позиции задержки в соответствующие частоты комбинационного рассеяния.

6. Ортогональная модуляция и двухцветная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг ортогональной модуляции необходим только тогда, когда требуется двухцветная визуализация в реальном времени. Схема этой схемы показана в Рисунок 5. В ортогональной модуляции используется пара ЭОМ, управляемых на четверти частоты лазера (20 МГц для лазера 80 МГц) со сдвигом фазы на 90° между ними. Этот шаг ортогональной модуляции можно пропустить для одноцветной визуализации SRS или гиперспектральной визуализации SRS.

1. Модуляция EOM1
   1. }Установите поляризационный светоделитель (PBS2), четвертьволновую пластину (QWP2) и вторую EOM (EOM2) в траекторию пучка Стокса после первой EOM. Отключите сигнальный вход от EOM2. Подключите сигнальный вход к EOM1 и включите его.
   2. Модулируйте луч Стокса (фиксированный на 1,040 нм) на частоте 20 МГц (f₀/4), направив луч через первую ЭОМ. Отрегулируйте наклон и положение EOM1, чтобы луч попадал прямо и по центру через кристалл EOM.
   3. Контролируйте глубину модуляции, наблюдая за обеими поляризациями, выходящими из PBS1 с помощью двух фотодиодов, и отображая модуляцию на осциллографе.
   4. Отрегулируйте напряжение QWP1, EOM1 и фазу входного сигнала 20 МГц (с помощью фазовращателя), чтобы оптимизировать глубину модуляции проходящего луча до уровня, близкого к 100%. Смотрите Рисунок 2B} для иллюстрации хорошей глубины модуляции.
2. Модуляция EOM2
   1. Отключите EOM1 и подключите EOM2.
   2. Отправьте высоковольтный выход второго усилителя на частоте 20 МГц на EOM2. Отрегулируйте наклон и положение EOM2, чтобы луч попадал прямо и по центру через кристалл EOM.
   3. Опять же, контролируйте глубину модуляции, глядя на обе поляризации, выходящие из PBS2, с помощью осциллографа. При необходимости отрегулируйте напряжение QWP2, EOM2 и фазовращатель для достижения модуляции, близкой к 100% для обеих поляризаций.
   4. Убедитесь, что модуляция последовательности импульсов имеет сдвиг фазы на 90° от первой модуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если две последовательности импульсов насоса не ортогональны на 90°, перекрестные помехи между двумя каналами будут проблемой.
   5. Проверьте ортогональность модуляции, включив и подключив EOM1 и EOM2. Контролируйте обе поляризации, разделяемые PBS2, с помощью осциллографа. Повторите оптимизацию EOM1 и EOM2 по отдельности, если последовательность импульсов после второго PBS не похожа на Рисунок 2C.
   6. Установите 20-миллиметровый двулучепреломляющий кварцевый кристалл (BRC) и полуволновую пластину (HWP) после EOM2. Подключите оба EOM одновременно и отслеживайте последовательность импульсов так, чтобы она напоминала Figure 2D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для чирика, используемого в этом эксперименте, 20 мм BRC индуцирует временную задержку, которая соответствует 80 см^-1 Рамановское смещение. При использовании другого ЛЧМ может потребоваться другая длина BRC.
3. Калибровка
   1. Откалибруйте систему с помощью ДМСО путем обнаружения сигналов с синхронного выхода каналов X и Y усилителя (отправленных на каналы 2 и 3 карты сбора данных).
   2. Проверьте, являются ли сигналы, генерируемые 2 913 см^-1}, пиковыми от более быстрой поляризации и от более медленной поляризации близкими к 90° противофазным на синхронном усилителе. Если это не так, отрегулируйте выравнивание EOM до тех пор, пока два сигнала не станут близкими к 90° противофазным.
   3. После завершения калибровки найдите положение задержки, которое исследует переход белка на расстоянии 2 930 см^-1 для одного из ортогональных пучков. Убедитесь, что другая поляризация зондирует липидный переход 2 850 см^-1.

7. Эпи-режим визуализации SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: В схеме визуализации в режиме пропускания объектив фокусирует лазер в образце, а затем конденсорная линза направляет проходящий луч на фотодиод для обнаружения захвата. В схеме эпимодальной визуализации свет, который обратно рассеян и деполяризован образцом, улавливается фокусирующим объективом и изолируется с помощью поляризационного светоделителя. Изолированные и обратно рассеянные фотоны направляются на фотодиод через пару релейных линз для обнаружения захвата. Рисунок 6 изображает схему визуализации в эпирежиме.

1. Установите HWP до того, как луч попадет в микроскоп, чтобы изменить поляризацию луча, идущего в микроскоп. Поместите PBS над объективом, чтобы деполяризованный обратный отраженный луч достигал детектора.
2. Используйте пару линз, состоящих из ахроматной линзы 75 мм и асферической линзы 30 мм, чтобы передать обратно рассеянные фотоны от задней апертуры объектива к фотоприемнику. Установите детектор для сбора обратного рассеянного света, направленного PBS. Установите фильтр, чтобы блокировать попадание модулированного луча в детектор.
3. Поместите образец ткани под объектив. Поскольку конденсатор не нужен для визуализации в эпирежиме, снимите его, если требуется больше места.
4. Визуализация
   1. Заблокируйте луч с помощью затвора; посветите на образец сбоку источником белого света; и используйте Brightfield для поиска объективного фокуса.
   2. Разблокируйте оба луча и используйте предварительно откалиброванные положения задержки для получения изображений липидов и белков SRS из тканей с двух выходов синхронного усилителя.
   3. Отрегулируйте усиление блокировки и коэффициент ячейки пикселей для получения изображений хорошего качества.

8. Окрашивание ложными цветами

1. Откройте стек изображений с помощью ImageJ.
2. Вытащите два изображения, которые соответствуют липидному (2,850 см^-1) и белку (2,930 см^-1) виду, щелкнув правой кнопкой мыши по изображению и кликнув на Дубликат.
3. Переименуйте изображение липидов в липиды }, а изображение белка на }белки.
4. Перейдите в Процесс | Калькулятор изображений и выполнить белки вычесть {{}}липиды.
5. Объедините изображения, перейдя по адресу Изображение | Цвет | Объединяйте каналы, устанавливая } липиды зеленые } и }{{TAG_917} до }}. Откройте инструмент Image channels (Изображение | Цвет | Инструмент каналов) и отрегулируйте яркость и контрастность (Изображение | Настройка | Яркость/контрастность).
6. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала с помощью инструмента каналы . Для липидного канала отрегулируйте контраст до тех пор, пока клеточные элементы не станут темными. Для белкового канала отрегулируйте контраст до тех пор, пока клеточные особенности не станут синими. Преобразуйте объединённое зелёное/синее изображение канала в изображение RGB, перейдя по адресу Изображение | Тип | Цвет RGB. Экспортируйте это изображение с помощью Файл | Сохранить как | Tiff.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для ложного окрашивания H&E цветовая схема показывает розовую цитоплазму, в то время как ядра имеют темно-сине-фиолетовый цвет.
7. Загрузите скрипт HE.m MATLAB из ресурса false H&E staining script в Table of Materials.
8. Запустите скрипт HE.m в MATLAB. Выберите экспортированное изображение RGB из предыдущего шага, чтобы создать искусственно окрашенное изображение.
9. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Нормализуйте интенсивность изображения для визуализации с большим полем зрения, поскольку изображение кажется темнее на периферии, чем в центре.
   1. Чтобы выполнить нормализацию полей изображений, усредните как можно больше изображений. Затем удалите функции интенсивности с помощью ImageJ (Process | Фильтры | Размытие по Гауссу | Радиус=50).
   2. Измерьте максимальную интенсивность размытого изображения (Ctrl+M). Разделите размытое изображение на максимальную интенсивность (Процесс | Математика | Разделить). Разделите необработанное изображение SRS на размытое изображение (Процесс | Изображение | Калькулятор).

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 мм Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, фокусное расстояние ахроматической линзы, 100 мм
20 МГц полосовой фильтр	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 МГц, 50 Ω
200 мм Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Широкополосный, 650 - 1,050 нм, фокусное расстояние ахроматического объектива, 200 мм
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Широкополосная полуволновая пластина
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Широкополосная четверть waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Можно использовать другие дихроики с центральной длиной волны около 1,000 нм.
DMSO (диметилсульфоксид)	Sigma Aldrich	472301	Растворитель для калибровки комбинационного сдвига. Можно использовать другие растворители с известными пиками комбинационного рассеяния.
Электрооптический амплитудный модулятор	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Для ортогональной модуляции и двухканальной визуализации необходимы два EOM. Рекомендуется резонансная версия, чтобы можно было использовать более низкое напряжение управления.
False H&E Staining Script	Matlab	<
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, для генерации частоты вождения EOM и ссылки на lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, время нарастания 1 нс
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Частотный разделитель (f/2, f/4, f/8, f/16), для генерация 20 МГц от лазерного выхода.
Высокодисперсионные стеклянные стержни	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Стержень 120 мм, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Лазерная система, способная выводить два синхронизированных импульсных лазера (один фиксированный луч на длине волны 1,040 нм и один настраиваемый луч в диапазоне от 680 до 1,300 нм) с частотой повторения 80 МГц.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in усилитель для извлечения сигнала SRS от фотодиода. Также можно использовать Zurich Instrument HF2LI или аналогичный инструмент.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Широкополосное диэлектрическое зеркало, 750 - 1,100 нм. Также можно использовать серебряные зеркала.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Каскад задержки для точного контроля временного перекрытия накачки и лазеров Стокса. Подойдет любая другая моторизованная сцена.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Можно использовать и другие конденсаторы с NA>1.2.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054<
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	Для сдвига фазы частоты модуляции
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode с большой площадью (10 x 10 см2). Можно использовать и другие диоды с большой площадью и малой емкостью.
Поляризационный светоделитель<	PBS9025-620-1000	Широкополосный поляризационный светоделитель
Refactive Index Database	<	refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Можно использовать другие призмы или ретрорефлектор.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	Мы использовали 5-миллиметровое зеркало с серебряным покрытием
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Программное обеспечение для управления лазерным сканирующим микроскопом
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25,0 мм, длина волны среза: 1 000 нм. Для эффективного подавления синдрома Стокса могут потребоваться два фильтра.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Можно использовать любую другую рамку для микроскопа. При наличии лазерного сканирующего микроскопа его можно использовать напрямую. В противном случае к микроскопу нужно было добавить гальвосканер и сканирующую линзу.
Цель погружения в воду	Olympus	XLPLN25XWMP2	Многофотонная цель 25X имеет NA 1.05. Можно использовать и другие подобные цели.

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>https://github.com/TheFuGroup/HE_Stainingtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Любой другой осциллограф с полосой пропускания 400 МГц или выше должен работать.td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Union Optictd style='overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:bottom;'>