Двухфотонная микроскопия астроцитов и возбуждающих нейронов в очищенной ткани гиппокампа мыши

Аннотация

Источник: Рафаэли, Р., и др., исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге. J. Vis. Exp. (2022)
}

В видео демонстрируется приготовление камеру и нейровизуализацию очищенной ткани гиппокампа мыши с помощью двухфотонной микроскопии для визуализации пространственных взаимодействий между флуоресцентно мечеными астроцитами и возбуждающими нейронами.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется предметное стекло с камерой визуализации, в которую будет помещен образец.

1. Поместите образец в центр предметного стекла.
2. С помощью пистолета для горячего клея создайте стенки по краям горки, почти на высоте ткани. Обязательно оставьте небольшой зазор (примерно 5 мм) в одном из углов (Рисунок 1A, B).
3. Нанесите на образец 1-2 капли раствора для определения показателя преломления или RIMS, чтобы сохранить верхнюю поверхность влажной и предотвратить образование пузырьков между покровным стеклом и тканью.
4. Сразу после нанесения капель RIMS (Refractive index matching solution) добавьте последний слой горячего клея на стенки (так, чтобы они достигали высоты мозга/среза) и сразу же (пока горячий клей еще жидкий) перейдите к шагу 1.5.
5. Заклейте верхнюю часть покровным стеклом, расположив его как можно ровнее на верхней части еще теплого слоя горячего клея (Рисунок 1C).
6. Заполните камеру RIMS через зазор, оставленный в стенках горячего клея (Рисунок 1D, E).
7. Закройте зазор горячим клеем. Не оставляйте воздуха внутри (Рисунок 1F).
8. Если стенки горячего клея выходят за границы горки, обрежьте выступающие края (Рисунок 1G).
9. Если объектив, используемый для визуализации, погружной, добавьте еще 2-3 мм клея на стенки над покровным стеклом, чтобы раствор для погружения держался дольше (Рисунок 1H).

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Вирусный вектор, используемый для обнаружения астроцитов
AAV5-CaMKII::eGFP<		Вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронов
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронных ядер
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		Вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронов
Imaris software	Bitplane, UK		Программное обеспечение, позволяющее проводить 3D-анализ изображений
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SyGlass software	<	Программное обеспечение, которое позволяет 3D-анализировать изображения с использованием виртуальной реальности
Двухфотонный микроскоп	Neurolabware		Ti:сапфировый лазер (Chameleon Discovery TPC, Coherent), фотоумножитель GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), полосовой фильтр (Semrock), объектив для погружения в воду 16x (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>ELSC Vector Core Facility (EVCF)td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>