Визуализация синаптогенеза гранулярных нейронов мозжечка на разных стадиях развития

Аннотация

Источник: Chan, США, et al., использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковой гранулы и развития синапсов. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует анализ развития нейронов мозжечковой гранулы путем визуализации предварительно зафиксированных срезов мозговой ткани у мышей, помеченных флуоресцентным белком, Получение изображений Z-стека с высоким разрешением с помощью конфокального микроскопа и измерение структурных параметров, включая длину нейрита, образование дендритного когтя, площадь поверхности и объем для изучения синаптогенеза.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Морфологический анализ гранулярных нейронов мозжечка или CGN - трехмерная (3D) реконструкция, площадь поверхности и клеточный объем

1. Изображение одиночных электропорированных CGN на конфокальном микроскопе с 63-кратным объективом с 2-кратным увеличением, получение z-стековых изображений со скоростью 0,5 мкм на стек. Изображение по одной ячейке в окне изображения, чтобы упростить анализ и реконструкцию изображения.
2. Установите подключаемый модуль Simple Neurite Tracer для FIJI, используя следующую ссылку (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), чтобы легко и эффективно отслеживать структуру электропорированных CGN в трехмерном (3D) пространстве.

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует обновленная версия плагина (https://imagej.net/SNT).

3. Анализируйте длину нейритов и образование дендритных когтей слепым образом с помощью простого нейритового трассера. Загрузите одноканальные z-стековые изображения электропорированных CGN на FIJI и нажмите на Плагины | Сегментация | Простой нейритовый трассер (Рисунок 1D).
4. Откройте выпадающее меню и выберите «Создать новый 3D-просмотрщик» (Figure 1D).
5. Прокрутите до основания дендрита, где он соединяется с клеточной сомой, и начните путь, щелкнув по соединению. Вручную обведите контур, щелкнув по участкам, где сигнал заполнения ячейки наиболее яркий, и нажав [y], чтобы сохранить трассировку. Обведите до конца дендрита, если он не содержит когтя, или до основания когтя и подтвердите путь, нажав [f] (Figure 2D).
6. Затем обведите коготь, начав путь у основания структуры и проследив до конца самого длинного нейрита. Отслеживайте вторичные и третичные ветви, удерживая нажатой клавишу [ctrl] в Windows или [alt] в Mac OS и щелкая по контуру. Подтвердите путь, нажав [f].
7. Обратите внимание, что измерения для трасс видны в отдельном окне; Сложите все измерения ветвей когтей (первичных, вторичных, третичных), чтобы получить общую длину каждого когтя.
8. Для анализа площади поверхности и клеточного объема электропорированных CGN загрузите программное обеспечение для анализа клеток Imaris (https://imaris.oxinst.com/).

ПРИМЕЧАНИЕ: FIJI также может быть использован для реконструкции ячеек в 3D из изображений z-стека с помощью легкодоступных и бесплатных плагинов. Кроме того, Simple Neurite Tracer имеет функцию объемного рендеринга, но Imaris был использован по причинам, изложенным ниже.

9. Загрузите изображение электропорированного CGN в формате z-stack на Imaris. Чтобы получить доступ к набору инструментов для 3D-реконструкции, нажмите Превзойти.
10. Чтобы восстановить CGN, нажмите клавишу «Поверхности» и выберите область интереса, которая охватывает всю ячейку в окне изображения. Когда закончите, нажмите синюю стрелку вперед в правом нижнем углу под кнопкой «Создать».
11. Если изображение содержит несколько каналов для разных сигналов, выберите канал, содержащий электропорированную CGN, и нажмите синюю стрелку вперед.
12. С помощью боковой панели установите нужный порог, который наиболее точно соответствует сигналу электропорируемой ячейки. Увеличьте масштаб ближе к поверхности ячейки, чтобы точно определить порог. Когда закончите, нажмите двойную зеленую стрелку, чтобы восстановить ячейку и получить площадь поверхности и размер объема из метаданных.

Результаты

Материалы