Одновременная визуализация динамики микроглии и активности нейронов у бодрствующей мыши

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

Двухфотонная визуализация микроглии и динамики нейронов кальция in vivo

1. Привыкание мышей к микроскопу

1. Через три недели после операции введите мышам анестезию с 3% изофлураном и поместите мышь под объектив с 25-кратным увеличением двухфотонного микроскопа с помощью специально изготовленного стереотаксического инструмента (Рисунок 1C). Для настройки мышь устанавливается на верхнюю часть беговой дорожки и позволяет ей свободно бегать.
2. Примерно через 10 минут снимите мышь со предметного столика микроскопа и верните ее в домашнюю клетку. Повторяйте привыкание не менее 3 раз через день перед получением двухфотонного изображения.

2. Получение двухфотонного изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнять получение изображения более чем через 4 недели после операции, так как активация микроглии постепенно возвращается к базальному уровню.

1. Индуцируйте мышам анестезию с помощью 3% изофлурана и поместите мышь под объектив двухфотонного микроскопа с помощью специально изготовленного стереотаксического инструмента.
2. Установите специально изготовленное затеняющее устройство (Рисунок 1A и Рисунок 1B) и ЖК-монитор для визуальной стимуляции, как описано ниже (Рисунок 1D).
   1. Расположите линзу так, чтобы она сфокусировалась на поверхности мозга, а затем установите исходное положение линзы Z. Сохраняйте координаты x-y постоянными и поднимайте линзу объектива; Снимите мышь и стереотаксический инструмент с линзы объектива и беговой дорожки.
   2. Прикрепите затеняющее устройство к верхней части головной пластины с помощью силикона, который чернеется путем смешивания с порошком древесного угля, и убедитесь, что пространство между головной пластиной и затеняющим устройством хорошо герметизировано.
   3. Наполните затеняющее устройство дистиллированной водой, а затем снова закрепите мышь и стереотаксическую рамку под объективом и на беговой дорожке. Осторожно сбросьте фокальную плоскость на поверхности мозга, проверяя глубину линзы объектива.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать риска повреждения линзы объектива, сначала установите координаты xyz, а затем примените устройство затенения линзы объектива. Также разумно сначала установить крышку, а затем скорректировать координаты, но для этого варианта необходимо осторожное обращение.
   4. Накройте линзу объектива черной алюминиевой фольгой, чтобы избежать загрязнения света от ЖК-монитора, используемого для визуальной стимуляции через линзу объектива (Рисунок 1D). Установите 10-дюймовый ЖК-монитор на расстоянии 12,5 см перед глазами мыши, чтобы отображать визуальные стимулы (Рисунок 1D).
3. Сконфигурируйте фильтры сбора флуоресцентного излучения для флуоресценции EGFP (фильтр излучения 525/50 нм) и флуоресценции R-CaMP (фильтр излучения 593/46 нм) с длиной волны возбуждения с точностью до 1 000 нм. Получение изображений с пространственным разрешением 0,25 мкм/пиксель с использованием объектива 25x 1,1 NA и GaAsP PMT.
4. Найдите область визуализации, в которой нейроны R-CaMP (+) и микроглия EGFP (+) могут быть одновременно визуализированы в слое 2/3. Для этой конфигурации данные, полученные на рисунке Рисунок 2 , находились на глубине 100 мкм от поверхности пиала с использованием предварительного просмотра изображения в реальном времени. Поддерживайте мощность возбуждающего лазера как можно ниже, чтобы избежать фотообесцвечивания и повреждений, вызванных повышением локальной температуры в области изображения.
5. Получение изображений с частотой кадров 30 Гц. Одновременно с получением изображения предъявите дрейфующе-решетчатые визуальные стимулы со 100% контрастностью, 1,5 Гц, 0,04 циклов на градус в 12 направлениях в 6 ориентациях от 0° до 150° с шагом 30° к мыши.
6. После получения изображения снимите мышь с предметного столика микроскопа, отсоедините затеняющее устройство и стереотаксический инструмент от мыши и верните мышь в исходную клетку.

Рисунок 1: Настройка для in vivo двухфотонное изображение. (A) Дорсальный вид затеняющего устройства. (B) Вид сбоку на затеняющее устройство. (C) Вид мыши с устройством затенения на головной пластине под линзой объектива. Мышь ставится на беговую дорожку. (D) Вид под микроскопом двухфотонного возбуждения. Монитор, на котором отображаются визуальные стимулы, размещается в правой части фигуры. Линза объектива покрыта устройством затенения и черной алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить попадание света от монитора на линзу объектива.

Рисунок 2: Микроглиальная динамика и визуальные реакции в дендритном позвоночнике. (A-C) Усредненные по времени изображения микроглии EGFP (+) и нейронов R-CaMP (+) в слое 2/3 V1 у 12-недельной трансгенной мыши CX3XR1-EGFP. Интенсивность сигнала в каждом канале нормализовалась независимо. (D) Зрительные реакции в дендритном позвоночнике. Полосатые диаграммы с черными стрелками указывают направление раздражителей решетки, представленных в сроки, обозначенные серыми столбцами. В кальциевых следах серыми линиями обозначены отдельные реакции, а черной – их средние. На правой врезке желтая стрелка указывает на дендритный шип, в котором была создана область интереса (ROI) для получения следов кальция. (E) Микроглиальный процесс (голубой стрелка) показал быстрое втягивание за 10 с.