$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
Двухфотонная визуализация микроглии и динамики нейронов кальция in vivo
1. Привыкание мышей к микроскопу
- Через три недели после операции введите мышам анестезию с 3% изофлураном и поместите мышь под объектив с 25-кратным увеличением двухфотонного микроскопа с помощью специально изготовленного стереотаксического инструмента (Рисунок 1C). Для настройки мышь устанавливается на верхнюю часть беговой дорожки и позволяет ей свободно бегать.
- Примерно через 10 минут снимите мышь со предметного столика микроскопа и верните ее в домашнюю клетку. Повторяйте привыкание не менее 3 раз через день перед получением двухфотонного изображения.
2. Получение двухфотонного изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнять получение изображения более чем через 4 недели после операции, так как активация микроглии постепенно возвращается к базальному уровню.
- Индуцируйте мышам анестезию с помощью 3% изофлурана и поместите мышь под объектив двухфотонного микроскопа с помощью специально изготовленного стереотаксического инструмента.
- Установите специально изготовленное затеняющее устройство (Рисунок 1A и Рисунок 1B) и ЖК-монитор для визуальной стимуляции, как описано ниже (Рисунок 1D).
- Расположите линзу так, чтобы она сфокусировалась на поверхности мозга, а затем установите исходное положение линзы Z. Сохраняйте координаты x-y постоянными и поднимайте линзу объектива; Снимите мышь и стереотаксический инструмент с линзы объектива и беговой дорожки.
- Прикрепите затеняющее устройство к верхней части головной пластины с помощью силикона, который чернеется путем смешивания с порошком древесного угля, и убедитесь, что пространство между головной пластиной и затеняющим устройством хорошо герметизировано.
- Наполните затеняющее устройство дистиллированной водой, а затем снова закрепите мышь и стереотаксическую рамку под объективом и на беговой дорожке. Осторожно сбросьте фокальную плоскость на поверхности мозга, проверяя глубину линзы объектива.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать риска повреждения линзы объектива, сначала установите координаты xyz, а затем примените устройство затенения линзы объектива. Также разумно сначала установить крышку, а затем скорректировать координаты, но для этого варианта необходимо осторожное обращение. - Накройте линзу объектива черной алюминиевой фольгой, чтобы избежать загрязнения света от ЖК-монитора, используемого для визуальной стимуляции через линзу объектива (Рисунок 1D). Установите 10-дюймовый ЖК-монитор на расстоянии 12,5 см перед глазами мыши, чтобы отображать визуальные стимулы (Рисунок 1D).
- Сконфигурируйте фильтры сбора флуоресцентного излучения для флуоресценции EGFP (фильтр излучения 525/50 нм) и флуоресценции R-CaMP (фильтр излучения 593/46 нм) с длиной волны возбуждения с точностью до 1 000 нм. Получение изображений с пространственным разрешением 0,25 мкм/пиксель с использованием объектива 25x 1,1 NA и GaAsP PMT.
- Найдите область визуализации, в которой нейроны R-CaMP (+) и микроглия EGFP (+) могут быть одновременно визуализированы в слое 2/3. Для этой конфигурации данные, полученные на рисунке Рисунок 2 , находились на глубине 100 мкм от поверхности пиала с использованием предварительного просмотра изображения в реальном времени. Поддерживайте мощность возбуждающего лазера как можно ниже, чтобы избежать фотообесцвечивания и повреждений, вызванных повышением локальной температуры в области изображения.
- Получение изображений с частотой кадров 30 Гц. Одновременно с получением изображения предъявите дрейфующе-решетчатые визуальные стимулы со 100% контрастностью, 1,5 Гц, 0,04 циклов на градус в 12 направлениях в 6 ориентациях от 0° до 150° с шагом 30° к мыши.
- После получения изображения снимите мышь с предметного столика микроскопа, отсоедините затеняющее устройство и стереотаксический инструмент от мыши и верните мышь в исходную клетку.
