$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.
1. Тканевая обработка
ПРИМЕЧАНИЕ: После транскардиальной перфузии и постфиксации в 4% параформальдегиде (PFA), разведенном в 0,2 M фосфатном буфере в течение ночи при 4 °C, мозг переводится на 30% сахарозу в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение трех дней при 4 °C. После этого мозги замораживают на порошкообразном сухом льду и хранят при температуре -80 °C до раздела.
- Разделите правое и левое полушария вдоль средней линии мозга с помощью скальпеля. Затем случайным образом выберите одно или другое полушарие в первом мозге. После этого систематически переключайтесь между правым и левым полушариями (Figure 1AРисунок 1B).
- Поместите все отобранные секции последовательно в охлажденные контейнеры для нескольких тарелок, чтобы сохранить секции в порядке резки.
- 2. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отслеживать отдельные участки на протяжении всей процедуры окрашивания, поместите отобранные участки в сетки для окрашивания на 25 лунок. Используйте каждый 5-й срез, указав среднее итоговое число 12 (8-16) срезов на гиппокамп для иммуноокрашивания и последующего подсчета клеток.
- Перед подвыборкой каждого n-го раздела со случайным началом между разделами one и n (Рисунок 1C), переносите контейнеры с -20 °C на комнатную температуру (RT).
- NOTE: 2O2) разведенный в дистиллированной воде (dH2O) на 20 минут.
- 2O2 на 10 минут в RT.
- 22O на 15 минут.
- 3. Оценка общего количества BrdU-меченых нейронов с помощью оптического ректификатора
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите пилотное исследование с участием нескольких животных, чтобы определить оптимальные параметры выборки, такие как количество анализируемых секций и количество оптических диссекторов в отобранных секциях. Этот пилотный проект также обеспечивает предварительное CV (стандартное отклонение/среднее значение) и возможность корректировки CE для получения удовлетворительной точности оценок, определенных исследователем (более подробную информацию см. ниже). Аналогичным образом, анализ z-распределения будет учитывать следующие моменты: усадка ткани, качество окрашивания по всему срезу и распределение клеток по оси z.
- Проверьте толщину ткани в секциях, чтобы убедиться, что они подходят для использования оптического ректификатора, например, достаточно толстые для высоты выбранного диссектора, включая защитные зоны (см. ниже). NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'> Толщина ткани измеряется в нескольких местах в пределах интересующей области.
- Поместите слайды на моторизованный столик микроскопа и включите предпочитаемое стереологическое программное обеспечение.
- Рисунок 2Ae.g.,Figure 2B).
- Figure 2B<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>).
- NOTE:
- Выборка нейронов, меченных BrdU, и регистрация их z-позиции вместе с локальной толщиной секции, измеренной в выбранном углу каждого подсчитывающего кадра.
- NOTE:
- Очертите интересующую область на всех участках, подлежащих анализу, и зарегистрируйте области.
- NOTE:step).
- step<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal; font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap; '>, который обеспечит размер x-y-шага.
- Установите размер подсчетной рамки в произвольную единицу и выполните пилотную выборку BrdU-положительных нейронов с использованием параметров, полученных в разделах 3.3 и 3.4.
NOTE:NOTE: Рисунок 2B). Не учитывайте BrdU-положительные нейроны, которые касаются линий исключения при четком распознавании по интересующему признаку внутри высоты диссектора. Критически важно тщательно следовать этим правилам подсчета на протяжении всей стереологической количественной оценки.
NOTE:
