Количественное определение вновь сгенерированных нейронов в тканях мозга крыс с помощью метода оптического фракционатора

Аннотация

Источник: Олесен, М. В., {{}} и др. Метод оптического фракционатора для оценки количества клеток в модели электросудорожной терапии на крысах. J. vis. exp. (2017).

В видео демонстрируется техника количественного определения вновь сгенерированных нейронов в тканях мозга. Срезы ткани гиппокампа, содержащие меченые бромоксиуридином (BrdU) нейроны, окрашивали с помощью иммуногистохимии и затем количественно определяли по толщине ткани с помощью метода оптического фракционатора.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.

1. Тканевая обработка

ПРИМЕЧАНИЕ: После транскардиальной перфузии и постфиксации в 4% параформальдегиде (PFA), разведенном в 0,2 M фосфатном буфере в течение ночи при 4 °C, мозг переводится на 30% сахарозу в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение трех дней при 4 °C. После этого мозги замораживают на порошкообразном сухом льду и хранят при температуре -80 °C до раздела.

1. Разделите правое и левое полушария вдоль средней линии мозга с помощью скальпеля. Затем случайным образом выберите одно или другое полушарие в первом мозге. После этого систематически переключайтесь между правым и левым полушариями (Figure 1AРисунок 1B).
   1. Поместите все отобранные секции последовательно в охлажденные контейнеры для нескольких тарелок, чтобы сохранить секции в порядке резки.
   2. 2. Иммуноокрашивание

      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отслеживать отдельные участки на протяжении всей процедуры окрашивания, поместите отобранные участки в сетки для окрашивания на 25 лунок. Используйте каждый 5-й срез, указав среднее итоговое число 12 (8-16) срезов на гиппокамп для иммуноокрашивания и последующего подсчета клеток.

      1. Перед подвыборкой каждого n-го раздела со случайным началом между разделами one и n (Рисунок 1C), переносите контейнеры с -20 °C на комнатную температуру (RT).
      2. NOTE: ₂O₂) разведенный в дистиллированной воде (dH₂O) на 20 минут.
      4. ₂O₂ на 10 минут в RT.
      5. ₂₂O на 15 минут.
      6. 3. Оценка общего количества BrdU-меченых нейронов с помощью оптического ректификатора

         ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите пилотное исследование с участием нескольких животных, чтобы определить оптимальные параметры выборки, такие как количество анализируемых секций и количество оптических диссекторов в отобранных секциях. Этот пилотный проект также обеспечивает предварительное CV (стандартное отклонение/среднее значение) и возможность корректировки CE для получения удовлетворительной точности оценок, определенных исследователем (более подробную информацию см. ниже). Аналогичным образом, анализ z-распределения будет учитывать следующие моменты: усадка ткани, качество окрашивания по всему срезу и распределение клеток по оси z.

         1. Проверьте толщину ткани в секциях, чтобы убедиться, что они подходят для использования оптического ректификатора, например, достаточно толстые для высоты выбранного диссектора, включая защитные зоны (см. ниже). NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'> Толщина ткани измеряется в нескольких местах в пределах интересующей области.
            1. Поместите слайды на моторизованный столик микроскопа и включите предпочитаемое стереологическое программное обеспечение.
            2. Рисунок 2Ae.g.,Figure 2B).
            3. Figure 2B<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>).
         2. NOTE:
         3. Выборка нейронов, меченных BrdU, и регистрация их z-позиции вместе с локальной толщиной секции, измеренной в выбранном углу каждого подсчитывающего кадра.
         4. NOTE:
         5. Очертите интересующую область на всех участках, подлежащих анализу, и зарегистрируйте области.
         6. NOTE:_step).
         7. _step<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal; font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap; '>, который обеспечит размер x-y-шага.
      8. Установите размер подсчетной рамки в произвольную единицу и выполните пилотную выборку BrdU-положительных нейронов с использованием параметров, полученных в разделах 3.3 и 3.4.
         NOTE:NOTE: Рисунок 2B). Не учитывайте BrdU-положительные нейроны, которые касаются линий исключения при четком распознавании по интересующему признаку внутри высоты диссектора. Критически важно тщательно следовать этим правилам подсчета на протяжении всей стереологической количественной оценки.
         NOTE:

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU	Sigma-Aldrich	19-160
Cresyl Violet	Sigma-Aldrich	C5042	Содержит следующее материалы на 1 л: 0,2 г крезилфиал; 2,0 г<бр/>натрияацетат, 3 H2O; 3 мл ледяной<бр/>уксусной кислоты; 1000 мл destilled water
Cryoprotectant	Capital Region Pharmacy, DK<	Содержит следующие материалы: Сахароза; поливинилпирролидон PVP 40; фосфатбуфер натрия (0,2 M); этиленгликоль; деминерализованный вода.
dH2O	Capital Region Pharmacy, DK	817205
Diaminobenzidine – DAB	Sigma-Aldrich	D5637
Envision-HRP	DAKO	K4001	Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins
Этанол - 70 %	Plum A/S	201098
Ethanol - 96 %	Plum A/S	201104
Ethanol - 99.9 %	Plum A/S	201111
Fetal Bovine Serum	In Vitro	BI-04-003-1A	<
H2O2 30%	Capital Region Pharmacy, DK	896456	<
HCl	J. T. Baker	6081	<
Mounting medium	Sakura	4583	Tissue Tek
Mouse-anti-BrdU	Becton-Dickinson	347580	<
PBS buffer	Capital Region Pharmacy, DK	853436	pH = 7.4
PFA	VWR	28,794,295	pH = 7.4
Phosphate buffer	866533	0.1 моль/л, pH 7.4
Быстросохнущая монтажная среда	Histolab Products AB	801	Pertex
Sodium Tetraborat	Merck A/S	1,063,080,500<
Sucrose	Merck A/S	1,076,515,000
Triton X-100	Merck A/S	1,086,031,000
Xylene	VWR	28,973,363	<
Cover slips	Menzel-Gläser
Cryostat	Leica	CM1860
Digital Microcator	Heidenhain	VRZ 401
Стеклянная посуда	Brain Resaerch Laboratories	1256
Microscope	Nikon	Eclipse 80i	<
Microscope camera	DP72	<
Microscope slides	VWR	48311-703	SuperFrost+
Моторизованная сцена	Prior
Multidish Containers	Sigma-Aldrich	D6315-1CS	Nuclon 12-well
New-Cast software	Visiopharm	ver. 4.5.6.440
Objective 2x	Nikon	CFI Plan UW 2X	<
Objective 4x	Nikon	CFI Plan Fluor 4X	<
Objective 10x	Nikon	CFI Plan Fluor 10X	<
Nikon	CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil	Числовая апертура 1.40
Orbital shaker	Gemini BV<	Sarstedt
Slide rack	Sakura	4465
Slide окрашивание посуды	4457	Tissue-Tek
Specimen disc	Leica	14037008637<
Staining nets	Лаборатории по исследованию мозга	2512	25-колодцев

td style='font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>861334tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>td style='font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>CM-9td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <tr style='height:21px;'>