Продольная двухфотонная визуализация флуоресцентно меченых нейронов в гиппокампе живой мыши

Аннотация

Источник: Уливи, А. Ф., et. al. Продольная двухфотонная визуализация спинного гиппокампа CA1 у живых мышей. J. Vis. exp. (2019)

Это видео демонстрирует продольную двухфотонную визуализацию флуоресцентно меченных пирамидальных нейронов у живой мыши. демонстрируя подготовку, выравнивание канюли и визуализацию дендритов и дендритных шипиков для изучения структуры нейронов в области CA1 гиппокампа.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка к сеансу визуализации
2. Включите установку визуализации заранее и дайте лазеру нагреться и стабилизироваться, если это необходимо.
3. Обезболите мышь. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии с 3% изофлураном в 1 л/мин O₂ и подождите, пока она потеряет сознание. Оцените анестезию с помощью теста на щипковый рефлекс на пальцах ног.
4. С помощью щипцов осторожно снимите клейкую пленку с пластины держателя головки. Держите мышь в руке, а пластину держателя головы пальцами. Аккуратно снимите пленку, чтобы не повредить препарат.
5. Поместите мышь под микроскопом, над ковром отопления, и закрепите головную пластину на держателе (Рисунок 1D).
6. Расположите носовой конус так, чтобы он охватывал рыло, и уменьшите изофлуран до 1,5-2%.
7. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
8. Очистите канюлю для визуализации, промыв ее деионизированной водой. С помощью шприца и тонкой иглы закапайте воду в канюлю, а с помощью вакуумного насоса удалите ее.

2. Сеанс визуализации

1. Используйте объективы с малым увеличением и большим рабочим расстоянием, чтобы визуально проверить канюлю на наличие остатков воды, грязи, целостности и флуоресценции.
2. Выровняйте канюлю по оптической оси, регулируя углы наклона рычагов держателя головки.
3. Переключитесь на объективы погружения в воду 25X 1.0 NA (числовая апертура), 4 мм WD (рабочий отрезок) или 40X 0.8 NA, 3 мм WD. Добавьте достаточное количество деионизированной воды, чтобы заполнить канюлю, и поддерживайте избыток воды в верхней части канюли. Не допускайте образования пузырьков воздуха.
4. Используйте двухфотонное (2P) возбуждение и изображение флуоресцентных сигналов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол визуализации сильно зависит от временных и пространственных масштабов, которые должны быть изображены. Пожалуйста, обратитесь к репрезентативным результатам и обсуждению раздела для получения подробной информации о настройках изображения, которые мы использовали для создания изображений, показанных в этой статье.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трубка из нержавеющей стали Ø 3,0 x 0,25 мм (внутренний Ø 2,5 мм) L = 500 мм	Sawade	R00303	Трубка из нержавеющей стали для металлического кольца канюли
Защитное стекло микроскопа (круглая 4 мм)	Engelbrecht Medizin and Labortechnik		Стеклянные покровные стекла для стекла канюли
Isofluran CP, Flasche 250 мл	Henry Schein VET GmbH	798932<
Гарвардский аппарат Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Isoflurane vaporizer
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014<
CMA 450 Temperature Controller	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	Одеяло с подогревом
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG	<
Head plates	Custom made		30 мм x 10 мм размер; отверстие 8 мм, титан
	держатель для головной тарелки
Пьедестал-держатели столбов	Thorlabs	PH20E/M	Держатель для головной тарелки
Столб из нержавеющей стали	Thorlabs	TR30/M	Держатель для головной тарелки
Столб из нержавеющей стали	Thorlabs	TR75/M	Держатель для головной тарелки
Столб из нержавеющей стали	Thorlabs	TR150/M	Держатель для головной тарелки
Post connector clamps	Custom made		Держатель для головной тарелки
Алюминиевая макетная плата, 300 мм x 450 мм x 12,7 мм, M6 Taps	Thorlabs	MB3045/M	Столик для микроскопа
7" x 4" Lab Jack	Thorlabs	L490/M	Столик для микроскопа
Низкопрофильная маска для лица маленьких мышей	Emka Technologies	VetFlo-0801	Держатель маски для лица для анестезии
Измеритель мощности модели 1918-R	Newport	<
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies	<
Двухфотонный микроскоп	Bruker	Ultima IV	Двухфотонные микроскопы
Двухфотонный микроскоп	Thorlabs	Бергамо	Двухфотонные микроскопы
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Objectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
Ultafast настраиваемый лазер для возбуждения 2P	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Excitaiton lasers
Ultafast настраиваемый лазер для возбуждения 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Excitaiton lasers
Ultafast настраиваемый лазер для возбуждения 3P	Coherent	Monaco	Excitaiton Лазеры

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal; overflow:hidden; padding:0px 3px; vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Liquid изофлуран для анестезииtd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal; overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Isoflurane scavenger systemtd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden; padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word; wrap-strategy:4;'>Ophtalmic ointmentCustom madetd style='background-color:#ffffff; цвет:#1a202c; font-family:Roboto; размер шрифта: 7pt; font-weight:normal; overflow:hidden; отступ: 0 пикселей 3 пикселя; vertical-align:bottom; пробел-спейс:нормальный; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4; ' >Измеритель мощностиtd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px; vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4; '>Флуоресцентная лампа