Продольная двухфотонная визуализация флуоресцентно меченых нейронов в гиппокампе живой мыши

Аннотация

Источник: Уливи, А. Ф., et. al. Продольная двухфотонная визуализация спинного гиппокампа CA1 у живых мышей. J. Vis. exp. (2019)

Это видео демонстрирует продольную двухфотонную визуализацию флуоресцентно меченных пирамидальных нейронов у живой мыши. демонстрируя подготовку, выравнивание канюли и визуализацию дендритов и дендритных шипиков для изучения структуры нейронов в области CA1 гиппокампа.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка к сеансу визуализации
2. Включите установку визуализации заранее и дайте лазеру нагреться и стабилизироваться, если это необходимо.
3. Обезболите мышь. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии с 3% изофлураном в 1 л/мин O₂ и подождите, пока она потеряет сознание. Оцените анестезию с помощью теста на щипковый рефлекс на пальцах ног.
4. С помощью щипцов осторожно снимите клейкую пленку с пластины держателя головки. Держите мышь в руке, а пластину держателя головы пальцами. Аккуратно снимите пленку, чтобы не повредить препарат.
5. Поместите мышь под микроскопом, над ковром отопления, и закрепите головную пластину на держателе (Рисунок 1D).
6. Расположите носовой конус так, чтобы он охватывал рыло, и уменьшите изофлуран до 1,5-2%.
7. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши.
8. Очистите канюлю для визуализации, промыв ее деионизированной водой. С помощью шприца и тонкой иглы закапайте воду в канюлю, а с помощью вакуумного насоса удалите ее.

2. Сеанс визуализации

1. Используйте объективы с малым увеличением и большим рабочим расстоянием, чтобы визуально проверить канюлю на наличие остатков воды, грязи, целостности и флуоресценции.
2. Выровняйте канюлю по оптической оси, регулируя углы наклона рычагов держателя головки.
3. Переключитесь на объективы погружения в воду 25X 1.0 NA (числовая апертура), 4 мм WD (рабочий отрезок) или 40X 0.8 NA, 3 мм WD. Добавьте достаточное количество деионизированной воды, чтобы заполнить канюлю, и поддерживайте избыток воды в верхней части канюли. Не допускайте образования пузырьков воздуха.
4. Используйте двухфотонное (2P) возбуждение и изображение флуоресцентных сигналов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол визуализации сильно зависит от временных и пространственных масштабов, которые должны быть изображены. Пожалуйста, обратитесь к репрезентативным результатам и обсуждению раздела для получения подробной информации о настройках изображения, которые мы использовали для создания изображений, показанных в этой статье.

Результаты

Материалы