Исследование происхождения сенсорных нейронов в твердой мозговой оболочке с помощью флуоресцентной микроскопии

Аннотация

Источник: Ванг, Дж., и др. Визуализация иммунореактивной иннервации твердой мозговой оболочки черепа крысы, связанной с геном кальцитонина, с иммунофлуоресценцией и нейронным отслеживанием. J. Vis. exp. (2021).

}Это видео демонстрирует метод отслеживания происхождения сенсорных нейронов в твердой мозговой оболочке с помощью флуоресцентной микроскопии. Ретроградный индикатор вводится в обнаженную твердую мозговую оболочку крысы, находящейся под наркозом. Индикатор захватывается аксонами сенсорных нейронов и перемещается ретроградно к их клеточным телам в пределах тройничного ганглия и ганглиев шейного дорсального корешка. Затем ганглии разрезаются, окрашиваются антителами, которые маркируют индикаторы и нейропептиды в телах клеток, и анализируются с помощью флуоресцентной микроскопии для подтверждения ганглионарного происхождения сенсорных нейронов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Ретроградное исследование с использованием фторзолота (FG)

1. Хирургические процедуры
   1. Определение области координат в твердой мозговой оболочке черепа крысы.
   2. Подготовьте микрошприц объемом 10 мкл и проверьте его жидким парафином.
   3. Обезболивание крыс раствором трибромэтанола (150 мг/кг) путем внутрибрюшинного введения. Проверяют глубину в анестезии по отсутствию реакции на защемление пальца ноги.
   4. Побрейте голову крысы электрической бритвой.
   5. Наденьте тупые ушные планки на крысу и поместите ее на стереотаксическое устройство. Затем наденьте держатель для рта и нанесите на глаза офтальмологическую мазь.
   6. Очистите хирургическое место кожи головы с помощью 10% повидон-йода и 75% этанола.
   7. Сделайте разрез по средней линии кожи головы.
   8. Тупо удалите надкостницу и мышечные ткани от черепа с помощью стерильных аппликаторов с ватными наконечниками (Рисунок 1A).
   9. Просверлите небольшое отверстие (~5-7 мм) с помощью сверла с заусенцами и сверлом с круглым наконечником (#106) на левой теменной и височной костях над средней менингеальной артерией (ММА) и убедитесь, что твердая мозговая оболочка черепа осталась нетронутой (Рисунок 1B).
   10. Постройте вокруг отверстия насыпь с помощью стоматологического силикатного цемента, чтобы ограничить распространение индикатора (Рисунок 1C).
   11. Добавьте 2 мкл 2% FG в отверстие вокруг ММА с помощью микрошприца объемом 10 мкл (Рисунок 1D).
   12. Закройте отверстие небольшим кусочком кровоостанавливающей губки.
   13. Положите на отверстие кусок парафиновой пленки и заклейте края костным воском, чтобы предотвратить утечку индикатора и избежать загрязнения окружающих тканей.
   14. Зашить рану стерильной нитью.
   15. Держите крыс в теплом месте до тех пор, пока они полностью не выздоровеют.
   16. Верните крыс обратно в клетки и добавьте в питьевую воду антибиотик и анальгетик.
2. Перфузии и секции
   1. Через 7 дней выживания перфузируйте этих крыс.
   2. Рассекаем ганглий тройничного нерва (ТГ) и ганглии дорсальных корешков C1-4 (DRG), затем фиксируем и криозащитируем их (Рисунок 1F).
   3. Разрезать ТГ и ДРГ толщиной 30 мкм на криостатной микротомной системе в сагиттальном направлении и установить на предметные стекла с силановым покрытием.
3. Двойная иммунофлюоресценция для мечения пептидов, связанных с генами FG и кальцитонина (CGRP), в TG и DRGs
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мечение FG можно непосредственно наблюдать при ультрафиолетовом (УФ) освещении под ртутной лампой без дополнительного окрашивания, меченные FG нейроны с FG были дополнительно исследованы в ТГ и шейных DRG с использованием двойных иммунофлюоресценций с FG и CGRP для выявления происхождение дуральных CGRP-иммунореактивных нервных волокон в ТГ и ДРГ.
   1. Обведите срезы гистохимическим пером.
   2. Инкубируйте секции в течение 30 минут в блокирующем растворе, содержащем 3% нормальной сыворотки ослика и 0,5% Triton X-100 в 0,1 М фосфатном буфере (PB).
   3. Перенесите образцы в раствор кролика антифторзолота (1:1000) и мышиного антитела к CGRP (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащем 1% нормальной ослиной сыворотки и 0,5% Тритон Х-100, на ночь при 4 °C.
   4. Промойте срезы три раза в 0,1 М ПБ на следующий день.
   5. Инкубировать в смешанном растворе осла против кролика Alexa Fluor 594 (1:500) и осла против мышей Alexa Fluor 488 (1:500) вторичного антитела в 0,1 М ПБ, содержащем 1% нормальной ослиной сыворотки и 0,5% Triton X-100 в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
   6. Вымойте и наклейте покровные стекла на секции.
4. Наблюдение и запись
   1. Получение изображений помеченных FG нейронов в ТГ и ДРГ под ультрафиолетовым освещением с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
   2. Получение изображений меченых FG и CGRP нейронов в TG и DRG под флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой.
   3. Используйте программное обеспечение для редактирования для регулировки яркости и контрастности изображений, а также для добавления меток на изображения.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen от Thermo Fisher Scientific	A21202	Защищать от света; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50	<
Olympus	Version 1.1	Программное обеспечение флуоресцентного микроскопа
Fluorogold (FG)	Fluorochrome<	Protect from light
Флуоресцентная система визуализации	Olympus	BX53	<
Freezing microtome	Thermo<
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	<
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop и иллюстрации	Adobe	CS6	Программное обеспечение для редактирования фотографий
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	Национальные институты по контролю за продуктами питания и лекарствами	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm

tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>52-9400tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Microm InternationalGmbHtr style='height:20px;'>