Мониторинг восстановления межнейромачтовых клеток у рыбок данио-рерио с помощью лазерной абляции

Аннотация

Источник: Вольпе, Б. А. , et др. } Лазерная абляция и регенерация на основе конфокального микроскопа в межневневромастных клетках данио-рерио. {{}}J. Vis. exp.{{TAG_ 31}} (2020)

}Это видео демонстрирует мониторинг восстановления межневневромастных клеток у рыбок данио-рерио с помощью конфокальной микроскопии, отслеживая гибель и восстановление клеток с помощью покадровой флуоресцентной визуализации.

Протокол

1. Постабляционная визуализация и покадровая микроскопия для изучения регенерации

1. Нажмите на выпадающее меню для "Каналы". В каналах отключите дорожку "DAPI"(4',6-диамидино-2-фенилиндол), чтобы инактивировать абляционный лазер. Нажмите на выпадающее меню для "Режим захвата".
2. В режиме захвата нажмите на "Zoom".
3. Уменьшите масштаб до 0,7 либо с помощью ползунка, либо введя "0,7."
   1. Чтобы обеспечить успешную абляцию клеток, увеличьте усиление до 900 и быстро сканируйте поле зрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целевой клетке или клетках не должен быть виден GFP (зеленый флуоресцентный белок). Используя те же или аналогичные настройки, которые описаны для визуализации до абляции, захватите и сохраните изображение после абляции (Рисунок 1C). Если на изображении видны остатки флуоресцентных клеток или дополнительные клеточные тела, которые необходимо удалить, повторите этапы лазерной абляции, чтобы создать видимый разрыв в цепочке межнейромачтовых клеток.
   2. Проверьте изображение канала T-PMT (Transmission Photomultiplier Tube) для дальнейшего подтверждения повреждения клеток. Поврежденные клетки будут иметь зернистый вид, а ядра будут часто набухать или приобретать неправильную форму (Рисунок 2).
4. После получения изображения перед абляцией, абляции клеток по мере необходимости и получения изображения после абляции для каждого отдельного положения стадии, настройте интервальную микроскопию, активировав как положение стадии, так и временные опции для захвата изображения. Установите временные параметры на 24 часа или другую желаемую конечную точку и интервалы в 15 минут. Начните эксперимент по получению изображений и сохраните полученный файл после завершения (на следующий день).
5. Если личинки подлежат дальнейшему изучению или выращиванию, осторожно извлеките их из агарозы с помощью тонких щипцов, затем перенесите в среду Е3 без трикаина для восстановления. Если они не будут использоваться в дальнейшем, усыпьте в соответствии с утвержденным протоколом для животных (быстрое и продолжительное погружение в ледяную ванну является распространенным методом) и утилизируйте их в соответствии с требованиями учреждения.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-well PTFE-Printed Slides<	63425-05
15 mM Tricaine stock solution<'	E10521	15 mM Трикейн в обратном осмосе вода
1X E3 + 600 μM Tricaine	<	Разбавьте 15 mM Tricaine stock в 25 раз в 1X E3 media
1X E3 media	<	Разбавьте 60X E3 media до 1X в воде обратного осмоса (16,7 мл/л)
60 X E3 media<		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 в 1 литре воды обратного осмоса
Bx60 Составной микроскоп с ртутной дуговой лампой флуоресценции	Olympus	<
LSM 700 конфокальный микроскоп, оснащенный лазерами 405 нм, 488 нм и 555 или 561 нм	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Для абляции использовался лазер мощностью 5 мВт 405 нм; Абляция и визуализация выполнялись с помощью объектива Plan-Apochromat 63x с NA 1.40
FIJI/ImageJ Image processing software	Multiple contributors		Downloadable at https://fiji.sc/
Игла для препарирования, модифицированная в нож для волос	Fisher Scientific	19010	Ресница была приклеена на конец иглы для препарирования с деревянной ручкой
программное обеспечение Microsoft Excel	Microsoft Corp.		Google sheets - это бесплатная альтернатива Microsoft Excel
Стеклянное дно посуды 35 мм с покровным стеклом No 1.5, окно 20 мм<	P35G-1.5-20-C	35 мм чашка Петри, стеклянное окно 20 мм
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Вставка Corning Netwell с полиэфирной сеткой 74 мкм, 24 мм Вставка	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Downloadable at https://rstudio.com/
SMX-168-BL Стереомикроскоп	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC	<

td style='font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal; overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Науки электронной микроскопииtd style='font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigmatd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4; '>Все компоненты, приобретенные у Sigma-Aldrichtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <tr style='height:20px;'>td style='font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word; wrap-strategy:4;'>Mattek Corporationtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>