Кальциевая визуализация активности энтеральных нейронов и глии в миентеральном сплетении толстой кишки мыши

Аннотация

Источник: Фрид, Д. Э., Гульбрансен, Б. Д. In Situ Ca²⁺ визуализация энтеральной нервной системы. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует кальций визуализация для визуализации и анализа активности энтеральных нейронов и глии в препаратах миентерального сплетения толстой кишки мышей.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующей экспертизой по этике животных. Комитет.

1.Prepare Модифицирован буфер Кребса.

Создайте модифицированный буфер Кребса таким образом, чтобы конечные концентрации (в мМ) компонентов были следующими: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl_2<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>, 1.2 MgCl_2<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal; font-variant:normal; font-weight:400; text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>, 1.2 NaH₂PO4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃²⁺2. Визуализация и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте хотя бы базовую установку для визуализации с флуоресцентным источником света, микроскопом, качественной CCD-камерой и соответствующим программным обеспечением для сбора данных. Варьируйте добавление других компонентов в зависимости от источника света и конкретного применения. Колесо фильтров и затвор должны использоваться с традиционным ксеноновым дуговым источником света. Однако светодиодные источники света и системы освещения не нуждаются в этих компонентах.

1. Расположите записывающую камеру под микроскопом и с помощью системы перфузии гравитационного потока с несколькими нагреваемыми резервуарами для шприцев установите непрерывную скорость перфузии 2–3 мл/мин при 37 °C Krebs buffer. Убедитесь, что вы не допускаете образования пузырьков воздуха как на входе, так и на всасывающей линии, подключенной к вакуумной ловушке.
2. NOTE: ²⁺²⁺ переходные процессы в нейронах.
3. NOTE:²⁺].
   1. Используйте модификацию метода, описанного ранее, используя ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, где F1 — флуоресценция в любой заданной точке, а F0 — базовая флуоресценция, для повышения точности оценки. Эта модификация помогает уменьшить шум от изменений флуоресценции в тканевых препаратах, которые демонстрируют движение мышечного слоя, лежащего под миентеральным сплетением.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose<	G8270
Insect pins	Fine Science Tools	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Potassium chloride	Sigma	P3911
Хлорид магния	Sigma<
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium dihydrophosphate	Sigma	S8282
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecular Probes	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigmatd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>M9272