$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Заполнение астроцитов ионофорезом
{{}}- Проверьте электрод.
- Аккуратно положите срез мозга в стеклянную миску с дном, наполненную 0,1 М PBS комнатной температуры. Удерживайте срез на месте с помощью платиновой арфы с нейлоновыми струнами.
- Убедитесь, что электрод подключен к источнику напряжения, и поместите заземляющий электрод в ванну, содержащую срез мозга.
- Переместите объект в интересующую область мозга.
- Опустите электрод в раствор. Переместите его под светлым полем зрения к центру поля зрения и внимательно рассмотрите с помощью 40-кратной линзы для погружения в воду, чтобы убедиться, что оно выглядит четким и без мусора или пузырей. Если наконечник электрода что-то засоряет, замените его на новый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Засорение является проблемой для электрода 200 МОм. При центрифугировании и фильтрации раствора красителя перед каждым экспериментом это не должно быть частой проблемой. Однако, поскольку кончик электрода маленький, ткань иногда может застрять в отверстии. Авторы не нашли способа предотвратить это, но с этим можно легко справиться, просто используя новый электрод. - Под светлым полем медленно опустите электрод к срезу, останавливаясь чуть выше поверхности.
- Заполнить астроциты ионофорезом.
- Идентификация астроцитов на глубине 40−50 мкм ниже поверхности среза с помощью инфракрасного дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC). Ищите клетки с удлиненными соматами овальной формы диаметром около 10 мкм. После того, как астроцит выбран, переместите его в центр поля зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая клетка для ионофореза имеет четкие, определенные границы вокруг нее. Не выбирайте ячейки, расположенные слишком близко к поверхности среза, потому что они не могут быть полностью заполнены. Требуется некоторая практика в течение нескольких дней, чтобы иметь возможность регулярно идентифицировать астроциты для заполнения красителем. В зависимости от области мозга, используемой для эксперимента, количество астроцитов может варьироваться. Это может повлиять на время, необходимое для идентификации астроцита перед заполнением. - Медленно опустите кончик электрода в срез, проходя через ткань, пока он не окажется в одной плоскости с телом клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещайте электрод медленно, чтобы не повредить ткань. - Как только клеточное тело астроцита станет четко видимым и очерченным, медленно и осторожно продвигайте электрод вперед. Перемещайте электрод до тех пор, пока кончик не пронзит сому клетки. Медленно перемещайте фокус объектива вверх и вниз, чтобы отметить, находится ли электрод внутри сомы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник электрода должен находиться внутри тела клетки, и должно быть видно небольшое углубление на соме. Не перемещайте электрод дальше, чтобы наконечник не проходил через ячейку. - Как только наконечник электрода окажется внутри ячейки, включите стимулятор на ~0,5−1 В и непрерывно выбрасывайте ток в ячейку. С помощью конфокального микроскопа наблюдайте за заполнением клеток. Увеличьте цифровое увеличение, чтобы рассмотреть детали элемента и убедиться, что кончик электрода виден внутри элемента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите напряжение, если кажется, что краситель вытекает из элемента или заполняет другие элементы поблизости. Если кажется, что краситель все еще вытекает из ячейки, медленно вытащите электрод и найдите другую ячейку. Важно, чтобы краситель не протекал, чтобы иметь высокое соотношение сигнал/фон на конечном изображении. - Подождите около 15 минут, пока более мелкие ветви и процессы не станут четкими, выключите напряжение и осторожно вытащите наконечник электрода из ячейки.
- Представьте заполненную ячейку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть выполнена сразу после заполнения. Объектив с более высокой числовой апертурой (NA) приводит к лучшему разрешению. - Подождите, пока клетка вернется в исходную форму, перед получением изображения (15−20 минут) с 40-кратным объективом. Чтобы отобразить ячейку, отрегулируйте настройку на конфокальной камере, чтобы убедиться, что более тонкие ветви и процессы выглядят четко определенными.
- Установите z-стек с шагом 0,3 мкм. Во время визуализации перемещайте объектив до тех пор, пока сигнал от ячейки не исчезнет, и установите его в верхнюю точку. Затем переместите объектив вниз (фокусируясь по ячейке) до тех пор, пока не исчезнет сигнал, установите его в качестве нижнего.