Встраивание мозга дрозофилы в матрицу для покадровой визуализации нейронов циркадных часов

Аннотация

Источник: Сабадо, В.В. , et др., Нагоши, Э. Флуоресцентная визуализация в реальном времени с разрешением одной клетки Drosophila Циркадные часы в мозге личинок Культура. J. Vis. Exp. (2018).

} Это видео демонстрирует процедуру встраивания мозг дрозофилы{{}}{{}}{{}} с последующей покадровой флуоресцентной визуализацией нейронов циркадных часов для анализа ритмической активности, синхронизированной со светлыми/темновыми циклами.

Протокол

1. Встраивание эксплантов мозга в 3D матрицу и монтаж (~20 мин).
   1. Погрузите расчлененный мозг в рабочий раствор фибриногена (конечная концентрация фибриногена ~3,3 мг/мл, 10,5 мкл на мозг) следующим образом:
   2. Аспирируйте 3,5 мкл активной среды Шнайдера (SAM)/антибиотиков. Аспирируйте расчлененный мозг из вскрытия в ту же пипетку, не распыляя среду SAM/антибиотиков в наконечнике.
   3. Выложите мозг и среду на крышку стерильной чашки Петри. Добавьте еще 3,5 мкл SAM/антибиотиков и 3,5 мкл теплого раствора фибриногена/SAM 10 мг/мл в каплю, содержащую мозг. Аккуратно перемешайте раствор вокруг мозга с помощью пипетки с помощью наконечника пипетки объемом 20 μл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пипетки вместо щипцов на этом этапе позволяет избежать нагрузки на мозг.
   4. Возьмите 2 мкл рабочего раствора фибриногена из капли и нанесите его маленьким кругом на покровную крышку посуды со стеклянным дном. Добавьте 0,8 мкл тромбина и очень быстро перемешайте с помощью наконечника для пипетки. Фибриноген превращается в фибрин и начинает полимеризоваться.
   5. Возьмите мозг, который находится в рабочем растворе фибриногена (шаг 1.1) между парой щипцов и поместите его на матрицу, как только станет видна белая матрица фибрина. Ориентируйте мозг передней стороной вниз (для визуализации часовых нейронов). Надавите на него как можно ближе к покровному стеклу. Фибриновый сгусток состоит из слоев фибрина. Выберите один слой и сложите его поверх мозга небольшими и мягкими движениями, не отрывая матрицу.
      1. Повторите от 2 до 3 раз из разных частей сгустка, чтобы стабилизировать работу мозга.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с мозгом с помощью щипцов будьте осторожны, чтобы не высушить его и не подвергнуть его физической нагрузке.
   6. Добавьте 20 мкл SAM/антибиотиков в верхнюю часть встроенного мозга, чтобы остановить действие тромбина.
   7. Повторите процедуру, чтобы смонтировать оставшиеся мозги. В чашку со стеклянным дном можно поместить до пяти-шести мозгов.
   8. Для долгосрочной визуализации в реальном времени добавьте 600 мкл SAM/антибиотиков во внутреннюю лунку (стеклянную часть). Поместите предварительно вырезанную мембрану из политетрафторэтилена (ПТФЭ) поверх среды и приклейте ее к вакуумной смазке, нанесенной на пластиковую часть дна (Рисунок 1A).

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
KH2PO	Sigma-Aldrich	P5655	Я не уверен, что это точно те же самые те, которые мы имеем в лаборатории. Я выбрал "подходит для культуры клеток насекомых", когда это доступно
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902	<
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	<
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1000	<
Insulin<	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429	<
L-(−)-Яблочная кислота	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Трегалоза дигидрат	Sigma-Aldrich	T0167
Янтарная кислота	Sigma-Aldrich	S9512
Fumaric acid	Sigma-Aldrich	F8509
α-Кетоглутаровая кислота	Sigma-Aldrich	K1128
Неинактивированный, Фетальная сыворотка теленка (FCS) на микоплазму и вирус	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I	<
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	<
Fibrinogen из плазмы крупного рогатого скота	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	ВНИМАНИЕ: Вредно при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Манипулируйте под ламинарным потоком
Тромбин из плазмы крупного рогатого скота	Sigma-Aldrich	T9549	ВНИМАНИЕ: Опасность для здоровья, используйте перчатки
PDF, NH2-NSELINSLLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
35 мм Блюдо, No 1.5 Coverslip, диаметр стекла 20 мм, без покрытия<	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip для культивирования тканей	Fisherscientific	08-772A	<
Sterile 500 мл Steritop-GP 33 мм резьбовой фильтр для бутылки, 0,22 мкм	Millipore	SCGPS05RE
Полиэтиленфторэтиленовая (ПТФЭ) пленка	Dupont	200A Teflon FEP Film	<
Millex-HV Шприцевой фильтрующий блок, 0,45 мкм, PVDF, 33 мм, гамма-стерилизованный	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 мкм, PVDF, 33 мм, гамма-стерилизованный	Millipore	SLGV033RS
Трехлунная стеклянная тарелка для вскрытия	Any company	<
Тонкие щипцы, размер 5, Dumont	Инструменты для тонкой науки	11254-20
Тандемный сканер инвертированный конфокальный микроскоп TCS SP5, с резонансным сканером и детекторами фотоумножителей HyD	Leica microsystem CMS GmbH
Камера контроля температуры	Life Imaging Services	Система контроля температуры CUBE & BOX, специально разработанная	<
Stage-top регулятор влажности	Услуги по визуализации жизни	custom made
Water Immersion Micro Dispenser: диспенсер, расширенная серия микро-насосов MP6 и программное обеспечение для контроллера объектива с автоматическим погружением	Leica microsystem CMS GmbH
Плагин для создания SUM-стека и дрейфа 3D-коррекции	ImageJ software
10x итеративная деконволюция	AutoQuant и программное обеспечение Imaris

4tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;' >tr style='height:20px;' >td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:12pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigma-Aldrichtr style='height:20px;' >tr style='height:20px;' >4tr style='height:21px;' >td style='background-color:#ffffff; цвет:#1a202c; font-family:Roboto; размер шрифта: 12pt; font-weight:normal; overflow:hidden; отступ: 0 пикселей 3 пикселя; vertical-align:bottom; пробел-спейс:нормальный; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4; ' >MatTektr style='height:21px;'>tr style='height:21px;'>td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> tr style='height:21px;'>