$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Покрытие клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из опыта, на эмбрион собирается около 100 000 жизнеспособных клеток. У 2-3-месячных беременных мышей обычно бывает 8-10 эмбрионов; следовательно, приблизительная оценка общего выхода клеток на одну беременную мышь составляет примерно 1 миллион клеток.
- Используя гемоцитометр, проведите подсчет клеток, а затем разбавьте суспензию до 2,000 клеток/мкл с помощью среды для культивирования клеток. Коротко растирать для перемешивания.
- Удалите покровные стекла с раствором ламинина из инкубатора и отсасывайте оставшийся раствор ламинина из покрытых покровных стекол с помощью вакуума. Быстро наклейте пластину, чтобы избежать полного высыхания покровных стекол. Нанесите пипетку объемом 100 μл (2,0 x 105 ячеек/покровное стекло) на каждую защитную крышку и поместите чашки Петри в инкубатор при температуре 37 °C на 1 час.
- Осторожно добавьте 3 мл среды для клеточной культуры в каждую чашку и поместите обратно в инкубатор при температуре 37 °C. Полусреду преформу менять 2 раза в неделю в течение 2 недель.
2. Заражение клеточной культуры через 14 (дней in vitro) DIV аденоассоциированными вирусными (AAV) векторами
- Для каждого блюда приготовьте 1 мл бессывороточной среды DMEM с 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (титр1,0 x 10 13)
- Аспирируйте свободную среду сыворотки, содержащую AAV, и замените на 3 мл среды для клеточных культур. Поместите посуду обратно в инкубатор с температурой 37 °C. Мы обнаружили, что 5-7 дней после инфицирования AAV позволяют достичь идеального уровня экспрессии GCaMP. Продолжайте менять среду каждые 2-3 дня на протяжении всего этого периода вирусной инфекции.
3. Живая конфокальная визуализацияCa2+ между 19-21 днями in vitro (DIV)
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть сделана между 5-7 днями после вирусной инфекции. Это идеальное окно для достижения видимой экспрессии флуорофора на уровнях, которые позволяют обнаруживать спонтанную активность Ca2+.
- Подготовка записывающих буферов
- Чтобы сделать 1 л записывающего буфера HEPES, добавьте: 9,009 г NaCl, 0,3728 г KCl, 0,901 г D-глюкозы, 2,381 г 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES), 2 мл 1 М раствора CaCl2 и 500 мл 1 М раствора MgCl2 к 800 мл стерильного дистиллированного H2O. Доведите pH до 7,4 с помощью NaOH. Доведите до конечного объема 1 л.
- Чтобы сделать 200 мл 20 мкМ глутаматного записывающего буфера, разбавьте 40 мкл 100 мМ стокового раствора глутамата в 200 мл записывающего буфера HEPES, описанного выше.
- Confocal imaging
- Заполните стерильную 35-миллиметровую чашку Петри 3 мл записывающего буфера.
- Извлеките 35-миллиметровую чашку Петри с зараженными культурами из инкубатора при температуре 37 °C. С помощью щипцов с тонким наконечником осторожно возьмитесь за край одного покровного стекла и быстро перенесите его в чашку Петри, заполненную записывающим буфером. Поместите оставшуюся защитную крышку при средней температуре обратно в инкубатор при температуре 37 °C. Транспортируйте чашку с записывающим буфером к конфокальному микроскопу.
- Запустите программное обеспечение для работы с изображениями. Перейдите к следующему шагу, пока он инициализируется.
- Запустите перистальтический насос и поместите строку в буфер записи. Откалибруйте скорость потока со скоростью 2 мл/мин.
- Перенесите зараженное покровное стекло из чашки Петри 35 мм в ванну для записи.
- Используя 10-кратный объектив для погружения в воду и светлый свет (BF), найдите плоскость фокусировки и найдите область с высокой плотностью тел нейронных клеток. Переключитесь на объектив с 40-кратным погружением в воду и используйте BF-свет для перефокусировки образца.
- В окне "Список красителей" в FluoView выберите AlexaFluor 488 и примените его.
- AAV-выражения могут быть вариативными; поэтому, чтобы предотвратить переэкспонирование и фотообесцвечивание флуорофоров, начните с низких настроек HV и мощности лазера. Для канала AlexaFluor 488 установите высокое напряжение (HV) на 500, коэффициент усиления на 1x и смещение на 0. Для лазерной линии 488 установите мощность на 5%. Чтобы увеличить эффективный объем, отображаемый в z-плоскости, увеличьте размер точечного отверстия до 300 мкм. Используйте опцию сканирования "focus x2" для оптимальной настройки сигналов излучения до уровней субнасыщения. Отсюда можно регулировать настройки до тех пор, пока не будет достигнута идеальная видимость каждого канала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы точно захватить весь диапазон потоков Ca2+ с помощью GCaMP, отрегулируйте базовые настройки HV и мощности лазера, чтобы обеспечить увеличение интенсивности флуоресценции без перенасыщения детектора. - Как только настройки микроскопа будут оптимизированы, переместите рабочую область, чтобы найти область с несколькими ячейками, отображающими спонтанные изменения флуоресценции GCaMP6f, и сфокусируйтесь на нужной плоскости для визуализации.
- Используйте инструмент "Clip rect", чтобы обрезать кадр до размера, который может достигать интервала кадров чуть менее 1 секунды. Это необходимо для установки интервала изображения в 1 кадр в секунду.
- Установите окно "Interval" на значение 1.0, а окно "Num" на 600.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы доставить различные записывающие буферы в желаемый момент времени (300 с), важно откалибровать задержку насоса для доставки нового раствора в ванну. Это будет зависеть от скорости перфузии раствора (2 мл/мин) и длины линии, используемой для перекачивания раствора. - Чтобы захватить фильм серии t, выберите опцию "Время", а затем используйте опцию сканирования "XYt", чтобы начать визуализацию.
- Следите за индикатором выполнения изображения и перемещайте линию из записывающего буфера HEPES в записывающий буфер глутамата 20 мкМ в соответствующий момент времени (например, если задержка насоса откалибрована для доставки раствора через 60 с, переместите линию в буфер глутамата через 240 кадров, чтобы доставить глутамат через 300 с).
- Когда съемка завершена, нажмите кнопку "Серия готова" и сохраните готовый фильм t-серии. Продолжайте перфузировать 20 мкМ глутамата в течение еще 5 минут, чтобы культивируемые нейроны подвергались воздействию глутамата в общей сложности 10 минут. Повторите этот процесс для каждого покровного листа, который будет изображен.
- После дополнительного 5-минутного воздействия 20 μМ глутамата, снимите покровное стекло из ванны и поместите обратно в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую записывающий буфер, до тех пор, пока день съемки не будет завершен
.