Визуализация кальция in vitro в краткосрочных и долгосрочных культурах гиппокампа крыс

Аннотация

Источник: Кальво-Родригес, и др. Флуоресцентная и биолюминесцентная визуализация субклеточного Ca²⁺ в старых нейронах гиппокампа. {{}}J. Vis. exp. (2015).

Это видео демонстрирует использование флуоресцентной визуализации для измерения уровня цитозольного кальция в краткосрочных и долгосрочных культурах гиппокампа крыс. Сравнивая молодые и старые нейроны, он показывает, как повышенная плотность потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа и длительная активация в старых нейронах приводят к перегрузке кальцием, что является отличительной чертой старения нейронов. Флуоресцентные индикаторы кальция выявляют эти различия через изменения интенсивности флуоресценции при стимуляции.

Протокол

1. Краткосрочная и долгосрочная культура нейронов гиппокампа крысы

1. Стерилизуйте стеклянные покровные стекла диаметром 12 мм в этаноле не менее 24 часов. Дайте им высохнуть в стерильных условиях.
2. ₂ инкубатор до использования.

Приготовьте 1,8 мл раствора папаина (непосредственно приобретенного) во флаконе (20 мкл/мл) в стерильных условиях: Для получения окончательной концентрации 20 мкл/мл добавьте около 40 мкл папаина в 1,8 мл Hank's плюс 0,6% бычьего сывороточного альбумина (BSA, μl следует рассчитывать в зависимости от условий поставщика). Hank's 0,6% BSA получают путем смешивания 85 мл среды Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) с 15 мл 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA, приготовленный раствор 4 г BSA в 100 мл HBSS). Готовят его в стерильной вытяжке.

₃₂Рисунок 1B²⁺ и Mg<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺ плюс 0,6% BSA и промыть ткань гиппокампа. Не удаляя носителя, разрежьте ткань на небольшие кусочки (примерно 2 х 2 мм) с помощью тех же глазных ножниц.

³ ячейки. Общее количество клеток будет зависеть от количества используемых животных.

Над четырехлуночной мультидиской тарелкой, содержащей 500 μл нейробазальной питательной среды, приготовленной ранее и хранившейся в инкубаторе, тарелка около 30 x 10 ячейки в капли около 50 μл на каждую лунку мультидиальной пластины, содержащей по одному покрытому поли-D-лизином стеклянному покровному стеклу диаметром 12 мм.

2инкубатор на 2-5 дней in vitro2. Флуоресцентная визуализация цитозольного Ca²⁺ Concentration

1. Подготовьте внешнее HEPES-буферизованное солевое раствор (HBS), содержащее, в mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, глюкоза 10, натрий-HEPES 10 (pH 7.42).
2. ²⁺-free, HEPES-buffered salt (HBS) раствор содержащий, в mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl₂ 1, глюкоза 10 и HEPES 10 (pH пункт 7.42).
3. ²⁺₂ 1, CaCl₂ 1, глюкоза 10 и HEPES 10 (pH 7.42).

Возьмите клеточную культуру, содержащую покровные стекла, из инкубатора и промойте их средой HBS при комнатной температуре (RT), перенеся их в новую четырехлуночную многолуночную тарелку, содержащую 500 μл HBS на лунку.

²⁺] в культивируемых клетках.

1. Включите лампу, микроскоп, перфузионную систему, флуоресцентную камеру и компьютер.
2. Note:
3. Откройте файл эксперимента. Используя программное обеспечение aquacosmos, нажмите на «Ratio» и выберите желаемый диапазон соотношений. Рассчитайте попиксельное соотношение в полученных изображениях, чтобы получить последовательность изображений с соотношением.

Результаты

Рисунок 1: Процедура выделения первичных нейронов гиппокампа кр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049	<
HBSS medium	Gibco	14170-088	<
Ham's F-12 medium<
DNase I (из поджелудочной железы крупного рогатого скота)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032	<
12 мм glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127<
4-well multidish plaques	Nunc	176740
чашки Петри	JD Catalan s.l.	2120044T	<
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies Technologies	F1201	<
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
NMDA	Sigma	M3262	<
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.		<
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER флуоресцентная камера	Hamamatsu	<
контроллер клапана VC-8	Warner Instruments		<
SH-27B отопление system	Warner Instruments	<
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics

tr style='height:20px;'>tr style='height:20px; '>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Gibcotr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> tr style='height:21px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>