Визуализация бета-амилоидных бляшек в срезах ткани головного мозга с помощью иммуномечения и окрашивания куркумином

Аннотация

Источник: Маити, П. et. al.,. Маркировка и визуализация амилоидных бляшек в тканях мозга с использованием природного полифенола куркумина. J. Vis. exp. (2019)

{Это видео демонстрирует процедуру визуализации бета-амилоидных бляшек в срезах ткани мозга с использованием иммуномаркировки и окрашивания куркумином. Иммуномаркировка обеспечивает специфичность бета-амилоида, в то время как куркумин избирательно связывается с фибриллами, богатыми β листами, улучшая визуализацию. Ко-кализация красной и зеленой флуоресценции подтверждает наличие бляшек.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

{{TAG_ 16}}1. Перфузия животных

1. Подготовьте фиксирующий и перфузионный буферы.
   1. Приготовьте 0,1 М натрийфосфатного буфера, добавив 80 г хлорида натрия (NaCl), 2 г хлорида калия (KCl), 21,7 г гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и двойная дистиллированная вода, чтобы получить в общей сложности 1 л.
   2. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA).
      1. Добавьте 40 г параформальдегида к 1 л фосфатно-солевого буфера (PBS) (0,1 М, pH 7,4).
      2. Нагрейте раствор PFA до 60−65 °C и перемешайте с помощью магнитной мешалки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Температура не должна превышать 65 °C.
      3. }Добавьте несколько капель гидроксида натрия (NaOH) (1 N) с помощью пипетки, чтобы полностью растворить PFA.
      4. Отфильтруйте раствор PFA с помощью фильтровальной бумаги средней и тонкой очистки и храните при температуре 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор годен в течение месяца.
2. Проводят анестезию и перфузию животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Двенадцатимесячный B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x семейная болезнь Альцгеймера }{{}}(5×FAD)) контрольные мыши соответствующего возраста (n = 6 в группе) были куплены у продавцов и выращены в зверевочнике Государственного университета долины Сагино. Генотипирование было подтверждено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Человеческая Болезнь Альцгеймера (AD) включает в себя посмертную ткань мозга AD и контрольную ткань соответствующего возраста.
   1. Обезболите животное подходящим обезболивающим средством, таким как пентобарбитал натрия (390 мг/кг массы тела) или смесью кетамина/ксилазина (до 80 мг/кг кетамина и 10 мг/кг массы тела ксилазина) путем внутрибрюшинной инъекции (игла 27 г и шприц 1 мл). Проверьте уровень анестезии, зажав палец ноги. Если животное не реагирует, то оно готово к операции по перфузии.
   2. Поместите животное под наркозом в положение лежа на спине на лотке для перфузионной хирургии и с помощью маленьких ножниц по радужной оболочке сделайте разрез на заднем конце левого желудочка.
   3. Введите перфузионную иглу 22-G в левый желудочек и сделайте небольшой разрез в правой ушной раковине, чтобы удалить перфузионную жидкость из организма. Используйте перфузионную систему с гравитационной подачей, чтобы обеспечить поток ледяной перфузионной жидкости (0,1 М PBS, pH 7,4) в течение 5−6 минут (скорость потока 20−25 мл/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистая печень является показателем оптимальной перфузии.
   4. Переключите буферный клапан на ледяной 4% раствор параформальдегида для фиксации и дайте ему течь в течение 8−10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тремор с последующим затвердеванием или ригидностью конечностей является показателем хорошей фиксации.
   5. Удалите мозг из черепа с помощью ножниц. С помощью шпателя соберите мозг и поместите его во флакон с 4% PFA (не менее чем в 10 раз больше объема мозга) и храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.

2. Обработка тканей

1. Разрезать срезы криостата.
   1. Переведите мозг в градуированные растворы сахарозы (10%, 20% и 30%) и храните при температуре 4 °C в течение 24 часов до использования.
   2. С помощью криостата при температуре -22 °C вырежьте срезы толщиной 40 мкм. Соберите по 10−20 срезов на лунку в 6-луночный планшет, заполненный PBS и азидом натрия (0,02%).

3. Колокализуйте cur(curcumin) антителом Aβ в бляшках Aβ и олигомерах.

1. Промойте срезы криостата с шага 2.1.2 PBS 3x в 12-луночной пластине.
2. Заблокируйте участки 10% нормальной козьей сывороткой (NGS), растворенной в PBS с 0,5% Triton-X-100 при комнатной температуре в течение 1 ч.
3. Выбросьте раствор для блокирования. Инкубировать срезы со специфическими амилоид-бета (Aβ)-антителами (6E10 или A11, разбавленными 1:200), растворенными в свежем блокирующем растворе, содержащем 10% NGS и 0,5% Triton-X100, в течение ночи при 4 °C в шейкере при 150 об/мин.
4. Выбросьте раствор антитела и промойте срезы PBS 3x в течение 10 минут каждый.
5. Инкубируйте с меткой вторичного антитела с красным флуорофором (например, Alexa
6. 594) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
7. Умывайтесь PBS 3x по 10 минут каждый.
8. Промыть 70% спиртом 1x.
9. Инкубируйте секции с куркумином (Cur (10 μM)) в течение 5 минут при комнатной температуре.
10. Умыться 70% спиртом 3 раза по 1 минуте.
11. Обезвоживайте 90% и 100% спиртом в течение 1 минуты каждый, очистите ксилолом 2 раза в течение 5 минут и установите на предметные стекла с помощью } Дистирольный пластификатор ксилол (DPX).
12. Визуализируйте с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами возбуждения/излучения для красного и зеленого сигналов.

Материалы