$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. In Vivo Двухфотонная флуоресцентная микроскопия в течение жизни{{}}
- Начните двухфотонную флуоресцентную микроскопию в течение жизни (2pFLIM) через 2 недели после установки черепного окна или позже. Сведите к минимуму экспериментальные помехи из-за стресса путем частого обращения с мышью и потирания ее до начала исследования визуализации, чтобы приучить мышь.
- Установите длину волны двухфотонного возбуждающего лазера на 960 нм с помощью программного обеспечения, которое управляет двухфотонным лазером.
- Обезболите мышь с помощью 4% изофлурана. Подтвердите правильную анестезию путем щипки за хвостом и наблюдения за частотой дыхания. То есть не должно быть никакой реакции на щипок хвостом и частота дыхания должна быть снижена до ~1 вдоха в секунду. Чтобы свести к минимуму ненужное время процедуры и поскольку анестезия длится всего две-три минуты, глазные смазки не используются.
- Перенесите мышь под наркозом на моторизованную беговую дорожку (Рисунок 1C) и установите оголовье мыши на держатель оголовья настройки беговой дорожки (подробнее см. Рисунок 1 ). Очистите поверхность черепного окна на мышке 70% этанолом.
- Поместите моторизованную беговую дорожку с установленной мышью под объектив 2pFLIM. Нанесите каплю дистиллированной воды между краниальной оконной крышкой и объективом.
- Дайте установленной мыши проснуться от анестезии и акклиматизироваться к беговой дорожке и микроскопу в течение как минимум 10 минут. Следите за частотой дыхания мыши, пока установленная мышь просыпается от анестезии.
- Перейдите к месту инъекции в разделе эпиподсветка. Документируйте реперные точки обозначения (т. е. кровеносные сосуды) под светлым полем, чтобы облегчить визуализацию той же области интереса (ROI) во время последующих сеансов визуализации.
- Исключите любой входящий свет, кроме света, излучаемого тканями мозга. Выключите источник света эпиподсветки и закройте корпус установки 2pFLIM. Активируйте 2pFLIM PMT, включив аппаратную команду управления напряжением.
- Получите изображение z-stack 2pFLIM с помощью программного обеспечения для сбора данных 2pFLIM FLIMimage со следующими рекомендуемыми настройками для визуализации tAKARα-положительных сомат у бодрствующих мышей. Установите усреднение кадров на 3 кадра, скорость сканирования на 2 мс/линию, размер изображения на 128 x 128 пикселей и поле зрения на 90−100 мкм. Отрегулируйте параметры изображения в зависимости от подготовки и конфигурации оборудования.
- Осмотрите полученное изображение в формате FLIM (программное обеспечение собственной разработки). Отрегулируйте параметры изображения, следуя шагу 1.9, чтобы оптимизировать количество фотонов и свести к минимуму фотообесцвечивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работоспособное интегрированное количество фотонов в ROI для пожизненной визуализации tAKARα-положительной сомы in vivo составляет ~1,000−10,000 фотонов в зависимости от амплитуды сигнала, полученного в результате конкретного стимула.
- Используйте уменьшенное поле зрения, уменьшенную скорость сканирования, увеличенную мощность лазера и увеличенное количество усредненных кадров, чтобы увеличить количество интегрированных фотонов и уменьшить ошибку оценки срока службы. В то же время обязательно используйте минимальную необходимую мощность лазера, усреднение кадров и скорость сканирования, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание.
- Изображение через регулярный интервал времени (например, каждые 30−60 с) путем повторения сбора z-стека с настройками, определенными в шаге 1.10. Получайте базовые изображения 2pFLIM в течение не менее 15 минут при нулевой скорости беговой дорожки.
- Установите скорость вращения беговой дорожки на ~15 см/с в течение 15 минут при получении изображений 2pFLIM. Продолжайте визуализацию в течение ≥20 мин после выключения вращения беговой дорожки, чтобы оценить продолжительность активности PKA после прекращения принудительного передвижения.
2. Анализ изображений 2pFLIM
1. Откройте полученные изображения в FLIMview и установите в FLIMview следующие параметры.
1. Нажмите на поля минимального и максимального диапазонов подсчета одиночных фотонов (SPC) в FLIMview. Введите соответствующее минимальное и максимальное значения дальности SPC, обычно в диапазоне от 1,2−2 до 10−12 нс соответственно.
2. Нажмите на поле t0} в FLIMview и введите значение t0 (обычно ~2 нс). Нажмите на поле минимального порогового значения яркости за время жизни в FLIMview и введите желаемое пороговое значение до 5−30 фотонов.
2. Нажмите на кнопку новой группы (N) и назначьте имя экспериментальной группы. При этом будет создана группа, объединяющая данные из каждого добавленного изображения FLIM.
3. Нажмите на кнопку ROI} в модуле Roi Controls{{}}} и нарисуйте ROI вокруг tAKARα-положительной сомы. Уменьшите диапазон z-стека, переместив нижний и верхний z-предел в ползунках z-stack Control} в FLIMview, чтобы свести к минимуму загрязнение сигнала, исходящее от фоновых фотонов на других глубинах z.
4. Нажмите на кнопку +, чтобы добавить изображение FLIM в группу (шаг 2.2). Нажмите кнопку Calc, чтобы рассчитать среднее время жизни (LT, также называемое средним временем испускания фотонов [MPET]), для ROI и ошибки оценки времени жизни (δτ).
5. Откройте следующий файл в хронологической серии изображений 2pFLIM. Повторите шаг 2.4. Обязательно отрегулируйте положение ROI и диапазона z-стека, чтобы измерить одну и ту же tAKARα-положительную сому с течением времени, потому что со временем может наблюдаться дрейф тканей.
6. Выберите deltaMPET/MPET0{{}}} в выпадающем меню модуля {{}}. Нажмите на поле baseline# и введите индексы (например, 1 2 3 4 5 для первых пяти изображений в группе, созданной на шаге 2.3). Это определит изображения, используемые для вычисления базового срока жизни (LT0).
7. Нажмите на Plot), чтобы создать график, содержащий отклик FLIM (ΔLT/LT0) tAKARα во время эксперимента с определенными ROI. Нормализованные изменения времени жизни (ΔLT) отдельных ROI на соответствующее базовое время жизни (LT0) позволяют сравнивать активность PKA во время локомоции по различным ROI.
