Трехмерная визуализация вирусной инфекции бешенства в тканях головного мозга мышей

Аннотация

Источник: Zaeck, L., et и др. 3D-визуализация инфекции вируса бешенства высокого разрешения в ткани мозга, очищенной растворителем. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует процесс подготовки и визуализации ткани мозга мыши, инфицированной вирусом бешенства (RABV), для оценки прогрессирования инфекции. В нем описаны ключевые этапы, включая окрашивание тканей флуоресцентными маркерами, обезвоживание, очистку и монтаж для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, кульминацией которых является создание трехмерного представления.

Протокол

, инфицированный RABV, фиксированный параформальдегидом (PFA) архивный материал мозга.

{{}}ВНИМАНИЕ: В этом протоколе используются различные токсичные и/или вредные вещества, включая PFA, метанол (MeOH), перекись водорода (H₂O₂), азид натрия (NaN₃}), tert-бутанол (TBA), бензиловый спирт (БА), бензилбензоат (ВВ) и дифениловый эфир (ДФЭ). MeOH и TBA легко воспламеняются. Избегайте контакта, надев соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз) и проводя эксперименты в вытяжном шкафу. Собирайте отходы отдельно в соответствующие контейнеры и утилизируйте их в соответствии с местными правилами. Вирус бешенства классифицируется как патоген уровня биобезопасности (BSL)-2 и, следовательно, может быть обработан в условиях BSL-2. Для некоторых видов деятельности, включая процедуры, которые могут образовывать аэрозоли, работать с высокими концентрациями вируса или работать с новыми лиссавирусами, может потребоваться классификация BSL-3. Доконтактная профилактика рекомендуется для персонала с высоким риском, включая лиц, ухаживающих за животными, и лабораторных работников. Обратитесь к постановлениям местных властей.

1. Фиксация ткани мозга и разрезание

1. Фиксация образцов мозга в соответствующем объеме 4% PFA в фосфатно-солевом буфере (PBS [pH 7,4]) в течение не менее 48 ч при 4 °C (с приблизительным отношением ткани к фиксации 1:10 [v/v]).
2. Промойте образцы тканей 3 раза в PBS в течение не менее 30 минут после каждой промывки и храните их в 0,02% NaN₃/PBS при 4 °C до использования.
3. Разрежьте ткань на участки толщиной 1 мм с помощью вибратома (скорость подачи лезвия: 0,3–0,5 мм/с, амплитуда: 1 мм, толщина среза: 1 000 мкм).
4. Чтобы сохранить правильную последовательность срезов, храните каждый участок ткани отдельно в лунке многолуночного планшета для культивирования клеток. Добавьте 0,02% NaN₃/PBS и храните срезы ткани при температуре 4 °C до использования.

2. Предварительная обработка образца метанолом

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы инкубации с мягкими колебаниями и, если не указано иное, при комнатной температуре. Защищайте образцы от света. Предварительная обработка образца служит общей цели улучшения диффузии антител и снижения аутофлуоресценции тканей при воздействии MeOH и H₂O{{}}₂, соответственно.

1. Приготовьте 20% (v/v), 40%, 60% и 80% растворы MeOH в дистиллированной воде. Например, для 20% MeOH добавьте 10 мл 100% MeOH в 40 мл дистиллированной воды в подходящем герметичном сосуде и перемешайте, перевернув его.
2. Переложите образцы в сосуды разумного размера (например, в реакционные пробирки объемом 5 мл). Следите за использованием материалов, устойчивых к химически стойким реагентам, используемым в этом протоколе. Например, обратите внимание, что в то время как полипропилен подходит, полистирол не подходит.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спецификации объема в этом протоколе относятся к реакционным пробиркам объемом 5 мл. Если используется другое судно, отрегулируйте объемы соответствующим образом.
3. Образцы инкубируют в 4 мл каждой концентрации приготовленной серии растворов MeOH в порядке возрастания в течение 1 ч каждая.
4. Инкубируйте образцы 2 раза по 1 ч каждый в чистом (100%) MeOH.
5. Охладите образцы до 4°C (например, в лабораторно безопасном холодильнике).
6. Приготовьте отбеливающий раствор (5% H₂O₂ в MeOH), например, разбавив 30% H{{}}₂O₂ в соотношении 1:6 в чистый (100%) MeOH и охладите его до 4 °C.
7. }Удалите 100% MeOH из охлажденных образцов и добавьте 4 мл предварительно охлажденного отбеливающего раствора (5% H₂O₂ в MeOH). Инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
8. Замените отбеливающий раствор на 4 мл 80% MeOH и инкубируйте в течение 1 часа. Продолжайте использовать приготовленную серию растворов MeOH в порядке убывания в течение 1 ч до тех пор, пока образцы не будут инкубированы в течение 1 ч в 4 мл 20% MeOH.
9. Промойте образцы 1 раз в течение 1 ч 4 мл PBS.

3. Иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ:} Выполняйте все этапы инкубации с мягкими колебаниями и, если не указано иное, при комнатной температуре. Защищайте образцы от света. Чтобы предотвратить рост микроорганизмов, добавьте NaN₃ до конечной концентрации 0,02% в растворы в этом разделе. Образцы тканей дополнительно проникают путем обработки неионогенными моющими средствами Triton X-100 и Tween 20. Нормальная сыворотка используется для блокирования связывания неспецифических антител. Глицин и гепарин добавляют для снижения фона иммуномаркировки.

1. Промойте образцы 2 раза в течение 1 ч каждый в 4 мл 0,2% Triton X-100/PBS.
2. Пермеабилизируйте образцы в течение 2 дней при 37 °C 4 мл 0,2% Triton X-100/20% диметилсульфоксида (ДМСО)/0,3 М глицина/PBS.
3. Блокируйте неспецифическое связывание антител путем инкубации образцов в течение 2 дней при 37 °C в 4 мл 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% нормальной сыворотки/PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нормальную сыворотку того же вида, в котором было выращено вторичное антитело, для достижения идеальных результатов блокирования.
4. Инкубируйте образцы в 2 мл раствора первичного антитела (3% нормальная сыворотка/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 с гепарином] + первичное антитело/антитела) в течение 5 дней при 37 °C. Обновите первичный раствор антитела через 2,5 дня.
   1. Для PTwH восстановите соль гепарина натрия в дистиллированной воде с получением исходного раствора 10 мг/мл (храните этот раствор в аликвотированном виде при температуре 4 °C). Добавьте исходный раствор до 0,2% Tween 20/PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор правильного разведения антител может потребовать оптимизации. Как правило, стандартные иммуногистохимические концентрации являются хорошей отправной точкой.
5. Промойте образцы в течение 1 дня в 4 мл PTwH, меняя буфер для промывки не менее 4–5 раз в течение дня и оставив окончательную промывку на ночь.
6. Инкубируйте образцы в 2 мл раствора вторичного антитела (3% нормальной сыворотки/PTwH + вторичное антитело/антитела) в течение 5 дней при 37 °C. Обновите раствор вторичного антитела через 2,5 дня.
   1. Разведите вторичное антитело/антитела в соотношении 1:500 в растворе вторичного антитела (т.е. 4 мкл в 2 мл).
7. Промойте образцы в течение 1 дня, как описано в шаге 3.5, оставив окончательную стирку на ночь.

4. Ядерное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ:} Выполняйте все этапы инкубации с мягкими колебаниями и, если не указано иное, при комнатной температуре. Защищайте образцы от света. Если ядерное окрашивание не требуется или для возбуждения или детектирования другого флуорофора требуется длина волны возбуждения/спектр излучения тиазола красного (TO-PRO-3), пропустите этот шаг.

1. Разбавьте краситель нуклеиновой кислоты TO-PRO-3 в соотношении 1:1,000 в PTwH и инкубируйте образцы в 4 мл раствора ядерного окрашивания в течение 5 ч.
2. {{}}Промойте образцы в течение 1 дня, как описано в шаге 3.5, оставив окончательную промывку на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После промывки образцы могут храниться в PBS при температуре 4 °C до оптического очищения.

5. Очистка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ:{{}}{{}}}{{}} Выполняйте все этапы инкубации с мягкими колебаниями и, если не указано иное, при комнатной температуре. Защищайте образцы от света. Образцы тканей обезвоживают в градуированной серии растворов TBA. Поскольку для иммуноокрашивания требуются водные растворы, все процедуры окрашивания должны быть завершены до очищения тканей. Согласование оптического клиренса и показателя преломления достигается путем обработки смесью BA, BB и DPE. Очищающий раствор дополняют DL-α-токоферолом в качестве антиоксиданта.

1. Приготовьте 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% и 96% растворы TBA в дистиллированной воде. Например, для 30% TBA добавьте 15 мл 100% TBA к 35 мл дистиллированной воды в подходящем герметичном сосуде и перемешайте путем инвертирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TBA имеет температуру плавления 25–26 °C; Таким образом, он имеет тенденцию быть твердым при комнатной температуре. Для приготовления растворов ТБА нагрейте хорошо закрытую бутылку при температуре 37 °C в инкубаторе или на водяной бане.
2. Обезвоживают образцы по 4 мл каждой концентрации приготовленного ряда растворов ТБА в порядке возрастания в течение 2 ч каждая. Оставьте 96% TBA на ночь.
3. Далее обезвоживайте образцы в чистом (100%) TBA в течение 2 ч.
4. Приготовьте очищающий раствор BABB-D15.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BABB-D15 представляет собой комбинацию BA и BB (BABB), которая смешивается с DPE в соотношении x:1, где x указано в названии решения, в данном случае 15.
   1. Для BABB смешайте одну часть BA с двумя частями BB.
   2. Смешайте BABB и DPE в соотношении 15:1.
   3. Добавьте 0,4 об.% DL-α-токоферола (витамин Е).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 20 мл BABB-D15 смешайте 6,25 мл BA с 12,5 мл BB. Добавьте 1,25 мл DPE и дополните его 0,08 мл DL-α-токоферола.
5. Очистите образцы в прозрачном растворе до тех пор, пока они не станут оптически прозрачными (2–6 часов).
6. Образцы могут храниться при температуре 4 °C в BABB-D15, защищенном от света, до монтажа и визуализации.

6. Монтаж образца

1. С помощью 3D-принтера напечатайте камеру визуализации и крышку (материал: сополиэстер [CPE], сопло: 0,25 мм, высота слоя: 0,06 мм, толщина стенки: 0,88 мм, количество стенок: 4, заполнение: 100%, без опорной конструкции).
2. Соберите камеру визуализации (Рисунок 1).
   1. Установите круглый покровный стекло (диаметр: 30 мм) на камеру визуализации с помощью силиконовой резины RTV-1 (однокомпонентная вулканизация при комнатной температуре). Удалите излишки силиконовой резины ватным тампоном, смоченным в воде, и высушите в течение ночи.
   2. Закрепите на крышке круглый покровный колпачок (диаметр: 22 мм) с силиконовой резиной RTV-1. Удалите излишки силиконовой резины ватным тампоном, смоченным в воде, и высушите в течение ночи.
3. Поместите образец в камеру для визуализации, добавьте небольшой объем BABB-D15 и закройте крышку. Заполните камеру BABB-D15 через входное отверстие с помощью иглы для подкожных инъекций (27 G x 3/4 дюйма [0,40 мм x 20 мм]).
4. Заглушите входное отверстие и загерметизируйте камеру визуализации силиконовым каучуком RTV-1. Вылечить на ночь в темноте.

7. Визуализация и обработка изображений

1. Настройте получение изображения, выбрав соответствующие лазерные линии в соответствии с используемыми флуорофорами. Отрегулируйте дальности обнаружения каждого детектора, чтобы предотвратить перекрытие сигнала между каналами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерные диапазоны обнаружения для Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 и TO-PRO-3 составляют 500–550 нм, 590–620 нм и 645–700 нм соответственно.
2. Выберите параметры сбора, определите верхнюю и нижнюю границы z-стека и получите стек изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерными параметрами сбора данных являются последовательное сканирование с размером пикселя 60-90 нм, размером z-шага 0,5 мкм, средним значением линии 1, скоростью сканирования 400 Гц и размером отверстия 1 единица Эйри.
3. Обработайте стек изображений с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (например, на Фиджи) для создания 3D-проекций или выполнения углубленного анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого размера получаемых файлов изображений, обычно необходимо использовать рабочую станцию.
   1. Откройте файл (файлы) для приобретения или изображения на Фиджи (Файл |{ {TAG_589}} Откройте | Выберите файлы).
      1. Если вы используете, например, файлы LIF, выберите или отмените выбор нужных опций в диалоговом окне «Биоформаты». Просмотр стека с помощью Hyperstack. Кроме этого, никаких специальных выборок или галочек не требуется. Нажмите OK.
      2. Если файл содержит несколько стеков изображений, выберите те, которые нужно проанализировать, и подтвердите, нажав OK.
   2. Выполните коррекцию обесцвечивания, разделив объединенное изображение на отдельные каналы (Изображение |{ {TAG_645}} Цвет | Инструмент каналов, затем выберите Больше | Разделенные каналы). Для каждого канала выберите коррекцию отбеливания (Изображение | Настройте | Коррекция отбеливателя) и выберите Простое соотношение} (интенсивность фона: 0.0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, например, когда нет линейного затухания сигнала или сигнал в целом слишком слабый, Simple Ratio может не работать. В качестве альтернативы попробуйте Экспоненциальная подгонка или пропустите коррекцию отбеливателя.
   3. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала с помощью ползунков (Изображение |{ {TAG_724}} Регулировка | Яркость | Контраст).
   4. Объедините каналы (Изображение {|{ {TAG_754}} Цвет | Объединение каналов), создание составного (}Изображение | Цвет | {{}}{{TAG_780 TAG_781}}, затем выберите Больше | {{}}}Сделайте составной), и преобразуйте его в формат RGB (Изображение | {TAG_802}}Цвет | Каналы Инструмент, затем выберите Больше TAG_819{{}}| Конвертировать в RGB).
   5. При необходимости измените размер стека изображений, чтобы уменьшить время вычислений и размер файла (Изображение | Настроить | Размер, оба варианта отмечены плюс билинейная интерполяция).
   6. Создание 3D-проекции (Изображение | }Стеки | 3D проект). Выберите Brightest Point} в качестве метода проекции и установите расстояние между срезами в соответствии с размером z-шага полученного стека изображений. Для максимального качества установите приращение угла поворота на 1 и включите интерполяцию. При необходимости измените общий поворот, пороги прозрачности и непрозрачность.
   7. При необходимости отрегулируйте контрастность и яркость, преобразовав 3D-проекцию обратно в 8-битный формат (Изображение | Type | 8-бит). Используйте соответствующие ползунки (Изображение | }Отрегулируйте | }Яркость | Контраст) и повторно преобразуйте стек изображений в формат RGB, как описано в шаге 7.3.4.
   8. Сохраните 3D-проекцию как . файл TIF (формат файла изображения) и файл .AVI (формат видеофайла).

Результаты

Материалы