$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Флуоресцентная микроскопия световых листов (LSFM) (2–3 ч)
- }{{}}
- Настройка световой оптики 5X/0.1 и оптики обнаружения 5X/0.16. Соберите держатель образца и капилляр для образца (внутренний диаметр 1,5 мм, зеленого цвета) и поместите их в микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству по эксплуатации микроскопа для получения подробных процедур настройки. - Установите эмбрион следующим образом:
- Подготовьте наконечник пипетки P200, отрезав верхнюю часть так, чтобы она соответствовала диаметру капилляра, и удалите заостренную часть (~ 3 мм) для насадки образца.
- Расплавьте затупленный конец наконечника пипетки с помощью небольшого пламени.
- Потушите пламя и быстро приложите зародыш вертикально к расплавленному концу.
- Подогните верхнюю часть наконечника пипетки к капилляру для образца.
- Дайте буферу камеры уравновеситься с эмбрионом в течение 1 минуты, чтобы очистить его от мусора или пузырьков.
- Используя программное обеспечение для визуализации, выберите Найдите капилляр } под Найдите {{}} и отрегулируйте оси x, y и z для позиционирования капилляра образца.
- Выберите Найдите образец и увеличьте масштаб до 0,6 раза, чтобы сфокусироваться на эмбрионе. Поверните эмбрион так, чтобы длинная ось изображенной конечности совпала со световой траекторией двух источников света (Рисунок 1B).
- Получение изображений
- В вкладке ) определите параметры пути света, такие как цели обнаружения, фильтр блокировки лазера, светоделитель, камеры и лазеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется канал зеленого флуоресцентного белка (GFP) (длина волны возбуждения: 488 нм; эмиссионный фильтр: полоса пропускания (BP) от 505 до 545 нм; светоделитель: SPS LP 560). - Установите флажок Pivot scan для уменьшения теней.
- Определите параметры сбора данных: глубина цвета, 16 бит; зум, 0,36-0,7X; Односторонняя подсветка (левая/правая) или двухсторонняя подсветка.
- Нажмите Непрерывный и установите интенсивность лазера, время экспозиции, мощность лазера и положение светового листа для получения более четких изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность лазера поддерживается как можно ниже, чтобы свести к минимуму фотоповреждения. - Нажмите СТОП , чтобы завершить получение изображения.
- Многомерное получение
- Определите z-стек, переместив позицию Z для первого и последнего изображения. Нажмите Оптимальный ), чтобы задать номер среза.
- Нажмите Начать эксперимент), чтобы получить выбранный z-стек.
- Когда это будет сделано, сохраните изображение в формате .czi.
- Обработка изображений (опционально)
- Продолжайте использовать под каналом , если применяется двусторонняя подсветка. {Многооконная обработка}необходима, если для объединения изображений с нескольких ракурсов получено несколько ракурсов.
- Создайте 2D-изображение, используя данные из пикселей максимальной интенсивности вдоль оси проекции в канале Проекция максимальной интенсивности.
- В канале Copy} нажмите Подмножество), чтобы выбрать поднаборы изображений из исходного набора.
2. Количественная оценка арборизации аксонов (30 мин для каждого отдельного нерва)
- Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений (по умолчанию изображение, содержащее данные XYZ, открывается в режиме Surpass и в виде 3D-рендеринга).
- Отрегулируйте цвет, яркость и контрастность изображения с помощью окна Настройка дисплея} (Редактировать | Show Display Adjustment) для обнаружения нитей накала на основе контраста локальной интенсивности.
- Нажмите на иконку Добавить новые нити} и выберите алгоритм Автопуть (без цикла)} в выпадающем меню.
- Выберите область интереса (в данном случае сегментирующий аксон интереса). Нажмите Далее когда закончите.
- Определите начальную и исходную точки, назначив самые большие и тонкие измерения диаметра, которые можно измерить с помощью режима Slice .
- Назначьте начальную точку на краю области интереса. Чтобы вручную добавить или удалить начальные точки, сначала измените режим указателя (Navigate | Выберите), а затем Shift + щелчок правой кнопкой мыши в точках интереса.
- Выберите ручные пороговые значения для начальных точек, чтобы убедиться, что все видимые арборизации помечены. Изменение режима указателя (Navigate | Выберите), а затем Shift + щелчок левой кнопкой мыши в точках интереса, чтобы вручную добавить или удалить начальные точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно вручную удалять фоновые шумы и сигналы от соседних нервов. - Установите флажок Удалить начальные точки вокруг начальных точек.
- Установите флажок Удалить разъединенные сегменты ), чтобы исключить точки, которые находятся слишком далеко и могут представлять собой фоновый шум. Укажите Максимальная длина промежутка на следующем шаге, чтобы определить верхний предел для исключения.
- Настройте порог для вычитания фона, который использует фильтр Гаусса для оценки интенсивности фона каждого воксела.
- Установите автоматический порог диаметра дендрита с помощью алгоритма Приблизительная площадь сечения.
- Пропустите шаги по расчету позвоночника.
- Завершите процесс и выберите нужный стиль и цвет.
- Снимите галочку с поля объема в Свойства , чтобы просмотреть только восстановленные аксоны.
- На вкладке Статистика ) выберите Подробное. Используйте Номер нити. Дендритные концевые точки для количественной оценки двигательных нервных окончаний в качестве индикатора арборизации моторных аксонов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статистическая аннотация может быть добавлена при желании. - Экспортируйте изображение восстановленного аксона в виде файла .tif.
