Анализ иммунных клеток в нервных тканях мышей с помощью проточной цитометрии

Аннотация

Источник: Хидмарк, А. С., }Анализ иммунных клеток в одиночных седалищных нервах и ганглии заднего корешка у одной мыши с помощью проточной цитометрии. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).

}Это видео демонстрирует использование проточной цитометрии для анализа иммунных клеток в седалищных нервах мышей и ганглиях дорсальных корешков (DRG). Процесс включает в себя мечение иммунных клеток антителами, меченными флуорофорами и биотинами, стабилизацию и проникновение клеток, а также использование флуоресцентных маркеров для определения клеточной поверхности и ядерных характеристик. Метод позволяет количественно оценить гетерогенность иммунных клеток в нервных тканях.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.

1. Переваривание седалищного нерва и DRG

NOTE:NOTE:NOTE:NOTE:2. Окрашивание седалищного нерва и DRG флуоресцентно мечеными антителами для проточной цитометрии
1. Перенесите 100 μL суспензии седалищного нерва или клеток DRG в V-образную лунку в 96-луночной пластине на льду.
   NOTE:NOTE:NOTE: Внимание: параформальдегид токсичен; носите соответствующие средства защиты, такие как перчатки и очки, и т.д..
   NOTE: NOTE:
2. NOTE:3. Настройка проточной цитометрии и запуск образцов
   NOTE:NOTE:

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/l глюкоза, глутамин, пируват)	Thermo	31885023	Источник этого материала не важен
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	<
td serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I из поджелудочной железы крупного рогатого скота I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma-Aldrich	E6758
Fetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Антитело против CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Клон M1/70
Антитело против MHC класса II, biotinylated	Biolegend	107603	Клон M5/114.15.2
Антитело против CD45-A647	Biolegend	107603	Клон 30-F11
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206		Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Используется для обнаружения MHCII-биотина с CD68-APC и F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Разбавить в PBS до 50x и хранить при температуре 4 °C в темноте
Cell dissociation sieve - набор для измельчения тканей	Sigma-Aldrich	CD1		V-Shaped, 96-well plates<	M8185
5ml полистриеновая трубка с круглым дном, 12x75 мм	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences

tr style='height:20px;' >td style='color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Greiner/Sigma