В этом видео мы демонстрируем использование спектральной оптической когерентной томографии (SD-OCT) для визуализации слоев сетчатки и оценки структурных изменений в генетически модифицированной модели мыши с оптической нейропатией.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация сетчатки мышей in vivo с помощью оптической когерентной томографии
1.4K просмотров
⸱
29 мая 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мыши
- Расширение и иммобилизация глаз
- }Не менее чем за 15 минут до сбора данных закапайте в глаза мыши 10% глазные капли фенилэфрина, удалите излишки, и закапывать 0,5% капель из глаз тропикамид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первая дилатация может быть выполнена сразу для всех мышей, которые будут протестированы в сеансе. Следите за тем, чтобы жидкости были комнатной температуры. - Сразу после введения общей анестезии (шаг 1.2) введите глазные капли 0,4% оксибупрокаина гидрохлорида, удерживая их на месте в течение 3 с для обезболивания и иммобилизации глаз. После этого сотрите капли и повторите закапывание 10% фенилэфрина и 0,5% тропикамида, чтобы убедиться, что глаза хорошо расширены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что жидкости имеют комнатную температуру и что мышь не проглатывает оксибупрокаин.
- }Не менее чем за 15 минут до сбора данных закапайте в глаза мыши 10% глазные капли фенилэфрина, удалите излишки, и закапывать 0,5% капель из глаз тропикамид.
- Общая анестезия
- Приготовьте обезболивающий раствор кетамина (20 мг/мл) и ксилазина (1,17 мг/мл) в физрастворе. Хранить при температуре 4 °C не более 2 недель.
- Примерно за 5 минут до исследования внутрибрюшинно вводите 5 - 10 мкл раствора анестетика на 1 г массы тела, в зависимости от возраста и размера мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые и/или худые мыши нуждаются в меньшем количестве анестезии, требуют меньше времени для обезболивания, но также быстрее просыпаются. Здесь 8 мкл/г (160 мг/кг кетамина, 9,33 мг/кг ксилазина). - По желанию смажьте глаза вязкими глазными каплями или офтальмологическим гелем, чтобы избежать сухости роговицы.
2. Позиционирование мыши
- Смажьте глаза глазными каплями на основе вязкого гликоля для увлажнения роговицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если глаза кажутся сухими во время обследования, повторно нанесите глазные капли. - Заверните мышь в лист хирургической марли, чтобы она оставалась теплой.
- С помощью губки или хлопчатобумажного фитиля нанесите тонкий слой офтальмологического геля с 0,3% гипромеллозы на каждый глаз, чтобы свести к минимуму преломление света, избежать помутнений и обеспечить увлажнение роговицы. При этом отодвиньте ресницы и усы в сторону.
- Расположите мышь в кассете так, чтобы голова была направлена прямо и вперед.
- Аккуратно откройте зажим прикусочной планки и поместите планку в рот; Используйте носовую ленту, чтобы зафиксировать положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что планка для укуса находится в середине кассеты. - Подложите ватный тампон под правую (левую) сторону, если проверяется правый (левый) глаз.
- Удерживая зажимной наконечник прицеливания на объективе, предназначенном для мыши, поднесите его к глазу, вращая винт Z-транслятора против часовой стрелки.
- Вращая и поворачивая кассету, а также поворачивая прикусочную планку и винты X-переводчика, заранее установите положение мыши; Цель состоит в том, чтобы правый глаз смотрел прямо в хрусталик и, таким образом, выровнял оптические оси глаз и хрусталика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь находится слишком высоко или слишком низко, сначала следует использовать винт Y-транслятора. - Выберите первый скан в разделе «Экзамен», нажмите «Начать прицеливание» и выполните дальнейшие ручные настройки для визуализации сетчатки.
- С помощью винта Z-транслятора переместите сетчатку вертикально на левой панели (Рисунок 1, Горизонтальное выравнивание B-скана) и горизонтально на правой панели (Рисунок 1, вертикальное выравнивание B-скана).
- Поверните кассету, чтобы переместить ONH в середину правой панели, переместив ONH вверх или вниз. С помощью прикусочного винта выпрямите сетчатку на правой панели. Поверните кассету, чтобы расположить ONH в центре левой панели.
- С помощью винта X-переводчика выровняйте сетчатку на левой панели. Помня об основной функции каждого модулятора, дополнительно отрегулируйте положение сетчатки, чтобы централизовать ONH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте винт Y-образного переводчика, чтобы перемещать ONH вверх и вниз на правой панели, если это необходимо. Положение может быть уточнено в любое время между сканированиями.
3. SD-ОКТ-визуализация ОНГ и сетчатки
- Удовлетворившись настройками, нажмите "Начать снимок", чтобы начать сканирование SD-ОКТ.
- Если 3D-визуализация не требуется, снимите галочку с опции OCU.
- Сохраните скан и отчет.
- Приступайте к следующему сканированию.
- Чтобы получить изображение второго глаза, после втягивания объектива поверните кассету соответствующим образом и повторите шаги 2.6 - 3.3.
4. Завершение сбора
- Когда сбор завершен, снимите мышь с кассеты, нанесите офтальмологический гель с 0,3% гипромеллозой на каждый глаз и поместите мышь на нагревательную пластину, чтобы проснуться.
- После последнего захвата закройте программное обеспечение и выключите компьютер и аппарат OCT (кнопка питания).
- Очистите кассету дезинфицирующим средством.
5. Анализ
- Для измерения толщины слоя сетчатки используйте программное обеспечение для автоматической сегментации, предоставленное производителем.
- Нажмите на кнопку «Пациент», выберите нужный «Обследование» из списка и нажмите на опцию «Просмотреть обследование».
- Загрузите нужные данные ОКТ в программное обеспечение ОКТ, щелкнув правой кнопкой мыши по значку папки в нужном сканировании.
- Щелкните правой кнопкой мыши по B-скану; Настройте штангенциркули, включив до 10 измерительных штангенциркулей; и введите их имена, углы и цвета.
- Выбор нужного суппорта щелчком правой кнопкой мыши по B-скану; Поместите его соответствующим образом на сетчатку глаза для измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сканирования, сосредоточенного на ONH, установите по 5 суппортов с каждой стороны от него, равноудаленных друг от друга. Для перипапиллярного анализа убедитесь, что штангенциркуль не расположен слишком далеко от ONH. Для радиального сканирования анализируйте 10 изображений за сканирование, выбранных программным обеспечением OCT. Их номера можно найти в папке «Отчеты». - Сохраните результаты для анализа в программе для работы с электронными таблицами, щелкнув правой кнопкой мыши на B-скане и выбрав «Сохранить результаты».
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты можно найти в той же папке, что и данные сканирования.
- В качестве альтернативы можно использовать самодельный макрос для штангенциркуля "MRI Retina Tool", разработанный для программы обработки изображений с открытым исходным кодом (см. Таблицу материалов).
- Убедитесь, что макросы "MRI Retina Tool" и "Modify Polygon Section Tool" активны. Загрузите изображение. Нажмите на кнопку m, чтобы начать измерение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Макрос автоматически создает одну измерительную кассету длиной 0,2 мм с обеих сторон ONH. Каждая кассета содержит 5 точек измерения, которые функционируют как штангенциркуль. Их боковое положение не подлежит изменению и подстраивается под перипапиллу при радиальном сканировании. Горизонтальное положение кассет предварительно определено для измерения толщины RNFL/GCL, но его можно легко изменить для измерения сложного слоя GC. Если качество сканирования оставляет желать лучшего, необходимо скорректировать горизонтальное положение, либо исключить изображение из анализа. - Для горизонтальной регулировки нажмите на кнопку e. В открывшемся окне «Менеджер ROI» выберите первую кассету.
- Нажмите на кнопку синего полигона и отрегулируйте положение первой кассеты, кликнув по границам измеряемого слоя на картинке.
- Повторите то же самое для второй кассеты, сначала выбрав ее в окне «Менеджер ROI», а затем кликнув по соответствующему изображению. Нажмите на кнопку r для повторного измерения. Просмотрите результаты в окне "Измерения".
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты могут быть скопированы в программу для работы с электронными таблицами в любое время. Они содержат следующие значения для правой кассеты (r), левой кассеты (l) и total: Intden - интегрированная плотность внутри кассеты; Площадь: площадь измерения, в мм2; Len: длина суппорта в кассете, в мм; Средняя: средняя интенсивность сигнала внутри кассеты; и Std: стандартная погрешность средней интенсивности сигнала. - Перейдите к следующему изображению.
- Дальнейший анализ данных в программе для работы с электронными таблицами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти среднюю толщину слоя, возьмите десять значений Len.
- Убедитесь, что макросы "MRI Retina Tool" и "Modify Polygon Section Tool" активны. Загрузите изображение. Нажмите на кнопку m, чтобы начать измерение.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | 'background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Opa1 мыши, несущие мутацию OPA1 c.2708_2711delTTAG на фоне C57Bl6/J | ||
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | 'background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Программное обеспечение для сбора и анализа OCT | ||
| ImageJ 1.48v | |||
| Саморегулирующаяся нагревательная пластина | |||
| Supplies | |||
| Марлевые салфетки 3"x3" | |||
| Dual End Cotton tip applicator< | 'background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Gel application | ||
| Cotton Twists | |||
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | 'background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-size:10pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word; wrap-strategy:4;'>Eye dillatation | ||
| Mydriaticum 0.5% | |||
| Cebesine 0.4% | |||
| Imalgene 1000 | |||
| Rompun | |||
| NaCl 0,9% | |||
| Systene Ultra | |||
| GenTeal' | |||
| Aniospray Surf 29 |
