Селективная однонейронная лазерная абляция у личинки данио-рерио с использованием конфокального микроскопа

Аннотация

Источник: Morsch, M., , Запуск клеточного стресса и смерти с помощью обычной УФ-лазерной конфокальной микроскопии. J. Vis. Exp. (2017)

Протокол

<

ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>

Подготовьте решения для встраивания рыбок данио-рерио в агарозу.

1. Приготовьте раствор для анестезии, добавив 4 г/л MS222 (раствор трикаина, pH 7.0) по каплям в чашку Петри, содержащую яичную воду. Доза 50 мг/л является рекомендуемой отправной точкой (Figure 1A<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>).
2. Figure 1B).
3. NOTE:
4. Чтобы сделать это, поместите ~ 300 μL агарозы вдоль внутреннего круга блюда со стеклянным дном, чтобы приготовить круг в форме пончика с небольшим отверстием посередине, в который поместите рыбу (шаг 1.5.3).

Выберите 1 - 3 из предварительно отсеянных рыб для абляции и обезболите личинок, перенеся их (с помощью переводной пипетки) в чашку с раствором для анестезии (шаг 1.4.1; Figure 1C; примерно 5 мин).
NOTE: Figure 1D).

Рисунок 1E). Если вы работаете с несколькими рыбами, выровняйте всех рыб в чашке так, чтобы их было легко найти с помощью конфокального микроскопа.
NOTE:Figure 1F).

2. Настройка конфокального микроскопа и параметров визуализации

1. Поместите чашку Петри со встроенной личинкой на столик для конфокального микроскопа и сосредоточьтесь на дорсальной стороне спинного мозга животного (используя яркое поле). Рассмотрите животное при соответствующем увеличении (40X) и флуоресцентной настройке и визуализируйте интересующую вас структуру (e.g.,Рисунок 2). Мы обычно используем объектив 40X для проведения наших покадровых исследований.
2. e.e., движение микроглии для определения базовой скорости и подвижности).
4. Используя z-drive, проверьте верхнюю и нижнюю часть интересующей структуры (e.e., ячейке сомы), вручную фокусируясь вверх и вниз. Запишите z-плоскость, которая будет удалена (e.g., центр ячейки).
   NOTE:e.g., Рисунок 43. Выполните целенаправленную лазерную абляцию отдельных клеток у рыбки данио-рерио Spinal Cord

   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого подхода к абляции и визуализации был использован конфокальный микроскоп (Leica SP5). Процедура абляции с использованием диода с длиной волны 405 нм для разрушения клеток подробно описана в программном обеспечении (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Тем не менее, любой обычный конфокальный микроскоп, оснащенный лазером с длиной волны 405 нм и модулем FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) или отбеливателем, позволит выполнять те же клеточные манипуляции, но потенциально с немного другими настройками, параметрами и названиями.

   1. Запустите мастер FRAP, нажав на выпадающее меню в верхней части меню программного обеспечения (Рисунок 3A, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>1 and <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>2). Обратите внимание на новое окно с различными шагами, которое позволяет настроить конкретные параметры для лазерной абляции (Рисунок 3B, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> 3).
   2. Figure 3B, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>4), и усреднять (Figure 3B, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>5). Наиболее подходящим был формат изображения 1 024 x 1 024 при скорости сканирования 400 Гц и среднем значении строки 4.
      NOTE:
   3. Если z-плоскость для абляции еще не выбрана (как описано в шаге 2.4.), нажмите кнопку "Live" и сфокусируйтесь на образце, пока флуоресцентная структура или желаемая z-плоскость, которая будет абляться, не окажется в фокусе.
5. Figure 3C, 6) для управления конкретными компонентами абляции.
   NOTE: A комбинация интенсивности лазера (Figure 3C, 8<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>), скорость сканирования и усреднение, которое было установлено на шаге 3.2 (Figure 3B, 4 и 5), а также количество повторений, которое будет установлено на шаге 3.5 (Рисунок 3E, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>12), определит общее время пребывания ультрафиолетового лазера на ROI и, следовательно, эффективность отбеливания.
   1. Задействуйте лазер с длиной волны 405 нм, активировав его для процедуры обесцвечивания (Figure 3C, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> 8).
      NOTE: Figure 3C, 7Figure 3D, 10) для абляции с помощью любого из инструментов рисования в окне получения изображения (Figure 3D, 9). Нацеливайтесь на бугорок аксона, например, с помощью инструмента для кругового рисования примерно 4 - 8 мкм.
      NOTE:Рисунок 3E, 11) и подтверждают количество циклов, в течение которых ROI будут сканироваться/абляться (Figure 3E, 12Figure 3E, style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>13) и следить за эффективностью абляции.
      NOTE:e.g.,Figure 3C<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>, 8<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400; text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>), скорость сканирования и усреднение (Figure 3B, 4 и 5) и повторения (Figure 3E, 12) в случае, если выбранный ROI все еще показывает высокую интенсивность флуоресценции после завершения FRAP цикл.

Результаты

Материалы