Визуализация TSPO-PET/CT для выявления образования инфаркта на мышиной модели ишемического инсульта

Аннотация

Источник: Чейни, А. М., et.al. ПЭТ-визуализация нейровоспаления с использованием [¹¹C]DPA-713 в мышиной модели ишемического инсульта. J. Vis. exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику визуализации in vivo нейровоспаления у мышей с моделью ишемического инсульта с использованием TSPO-специфичного радиоиндикатора. После инъекции радиоактивный индикатор связывается с TSPO, белком, расположенным на внешней мембране митохондрий и сверхэкспрессирующимся в активированных иммунных клетках. Сканер ПЭТ/КТ обнаруживает распределение радиоактивного индикатора и генерирует изображение, совпадающее с данными компьютерной томографии, что позволяет точно локализовать нейровоспалительные области в мозге.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Калибровка ПЭТ/КТ и настройка рабочего процесса (через 6 дней после операции dMCAO)

1. }Создать рабочий процесс визуализации в программном обеспечении для работы со сканером, включая регистрацию затухания КТ, 60-минутную динамическую регистрацию ПЭТ C-11 (дискриминация по уровню 350 - 650 кэВ, окно совпадения 3,438 нс), гистограмма (20 кадров: 5 x 15 сек, 4 x 1 мин, 11 x 5 мин; с коррекцией мертвого времени) и реконструкция 3DOSEM-OP (2 итерации, 18 подмножеств) для создания изображений 128 x 128 x 159 с размером вокселя 0,776 x 0,776 x 0,96 мм.
2. Выполните кондиционирование источника рентгеновского излучения с помощью калибровочной панели компьютерной томографии, расположенной в верхнем левом углу интерфейса. Эту калибровку необходимо выполнять еженедельно или перед сканированием, если система не использовалась в течение последних 48 часов.
3. Выполните калибровку темноты/светлого (D/L) и смещения центра (C/O).
   1. Нажмите кнопку калибровки компьютерной томографии (X) в левом верхнем углу интерфейса.
   2. Выберите D/L и C/O для файла компьютерной томографии, который вы будете выполнять, снимите станину с портала и запустите калибровку D/L.
   3. Вставьте станину калибровочного инструмента в сканер и запустите калибровку C/O, убедившись, что выбор на интерфейсе переключился на «инструмент для калибровки» вместо «палитра 70 мм».
4. Извлеките инструмент для калибровки и верните стандартную кровать из ПЭТ, обязательно изменив выбор на интерфейсе обратно на «Палитра 70 мм».
5. Закрепите ложе для визуализации с 4 мышами на платформе сканера с помощью ленты и прикрепите трубку для анестезии (Рисунок 1A). Убедитесь, что изофлуран течет по трубкам и что нет перегибов.
6. Сдвиньте кровать вперед так, чтобы она оказалась в центре поля зрения (FOV), закройте дверцу КТ и получите разведывательный обзор КТ, чтобы убедиться, что кровать находится в правильном положении.
7. Выполните «стандартную» калибровку сканера ПЭТ/КТ с использованием фантома собственного производства, содержащего известную дозу раствора C-11 в качестве источника излучения.
   1. Приготовьте шприц объемом 20 мл, наполненный дозой индикатора, эквивалентной дозе, вводимой одной мыши (~250 - 350 μCi/9 - 13 МБк индикатора C-11, разведенного в физрастворе).
   2. Запишите активность в стандарт с помощью калибратора дозы и отметьте время измерения.
   3. Проведите стандартное сканирование ПЭТ/КТ с использованием тех же параметров, которые будут использоваться для визуализации мышей (как описано выше). Делайте это еженедельно, чтобы создать поправочный коэффициент, который ПЭТ-сканер будет применять к данным визуализации.

2. Настройка рабочего пространства для визуализации ПЭТ/КТ

1. }Создайте стерильную среду с помощью дезинфицирующего средства с вироцидом (см. Таблица материалов) и разместите защитную абсорбирующую прокладку на всех поверхностях.
2. Убедитесь, что изофлуран и кислородные баллоны заполнены достаточно.
3. Подготовьте катетеры для лечения хвостовых вен, наполнив шприц объемом 1 мл (оснащенный наконечником иглы 27,5 G) 0,9% хлорида натрия (стерильный физиологический раствор) и промыв через катетер-бабочку 27,5 г диаметром 24 см. Отрежьте крылья катетера перед канюлированием, чтобы они не закрывали обзор хвостовой вены и чтобы облегчить перемещение мышей в сканер без смещения катетера.
4. Убедитесь, что на рабочем месте разложено все необходимое оборудование, включая запасные шприцы для промывки (наполненные стерильным физиологическим раствором), глазную смазку, тампоны с этанолом, тепловые лампы, подготовленные катетеры (предварительно заполненные физиологическим раствором), хирургическую ленту, тканевый клей, шприцы с дозой 0,5 мл, ножницы и зажигалку для герметизации катетера после успешной установки в хвостовую вену (Рисунок 1B).

3. Подготовка и канюляция животных

1. Взвесьте мышей, чтобы определить максимальный объем, разрешенный для введения каждой мыши (т.е., Объем индикатора и любой вводимый физиологический раствор не должен превышать 10% от массы тела).
2. Обезболивайте мышей в индукционной камере с использованием 3% изофлурана и поддерживайте на уровне 1-2% (2 л/мин 100% O₂).
3. Нанесите смазку для глаз на каждую мышь и подтвердите обезболивание с помощью педального рефлекса (щипки пальцев ног). При необходимости отрегулируйте уровень анестезии.
4. Поместите мышь на подогреваемую кровать с носовым конусом, чтобы доставить изофлуран в конусе 1-2% (2 л/мин 100% O₂).
5. Пока мышь находится под наркозом, выполните канюляцию хвостовой вены, используя следующий протокол:
   1. Положите мышь на бок, чтобы обнажить одну из боковых вен, в то время как голова остается в носовом конусе.
   2. Согрейте хвост с помощью тепловой лампы, стараясь не перегреть и не обжечь хвост, и промойте тампон спиртовой салфеткой, чтобы расширить вену и простерилизовать место инъекции.
   3. Держите иглу скосом вверх и выровняйте ее по вене под острым углом.
   4. Слегка надавите, чтобы проколоть кожу и выровняйте иглу так, чтобы она находилась на одной линии с веной.
   5. Аккуратно протолкните вперед на несколько миллиметров за скос, чтобы игла вошла в вену.
   6. Убедитесь, что катетер находится внутри, введя небольшой (10-20 мкл) промывку физиологического раствора. Физраствор должен плавно выходить из шприца, а вена должна очищаться. Если наблюдается какое-либо сопротивление или обратное давление, вполне вероятно, что катетер не находится в вене, и рекомендуется повторить попытку канюляции. Если наблюдается свертывание крови, используйте гепарин (1000 единиц гепарина на мл физиологического раствора) для установки канюляции и промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы оценили канюляцию с гепарином и без него у интересующего нас штамма мыши, и поскольку свертывания крови не наблюдалось, для канюляции использовался только физиологический раствор.
   7. Закрепите катетер на хвосте с помощью небольшой капли тканевого клея, а затем хирургической ленты, чтобы катетер оставался неподвижным при переносе мышей к сканеру.
   8. Извлеките промывочный шприц из конца катетера и закройте конец зажигалкой, убедившись, что исследователь не находится рядом с изофлураном или этанолом.
   9. Повторите то же самое для 3 дополнительных мышей, чтобы все 4 мыши, подлежащие сканированию, были канюлированы и подготовлены.
6. Включите поток анестезии (2,5% изофлурана, 2 л/мин 100% O₂), подключенный к ПЭТ/КТ, и осторожно расположите мышей лежа на ложе сканера, убедившись, что катетеры остаются на месте, а голова каждой мыши находится прямо и надежно внутри носового конуса. Прикрепите голову и тело каждой мыши к кровати мягкой хирургической лентой, чтобы дыхание не ограничивалось при размещении ленты. Запишите положение каждой мыши, чтобы обеспечить правильное местоположение и распределение групп для анализа изображений.
7. Держите мышей в тепле на протяжении всей процедуры (, например, , используя тепловую лампу или систему горячего воздуха, чтобы мыши оставались в тепле без перегрева). Контролируйте частоту дыхания всех мышей либо визуально при использовании открытого портала, либо с помощью системы удаленного мониторинга с использованием дыхательных подушечек, и изменяйте уровень анестезии по мере необходимости.

4. Регистрация компьютерной томографии

1. }Как только животные будут надежно находиться в кровати и дыхание станет стабильным, включите лазерное перекрестие и переместите сканирующую платформу так, чтобы они совпали с мозгом всех четырех мышей. Переместите ложе сканера в положение сбора данных (положение 3) так, чтобы мозг мышей находился как можно ближе к центру поля зрения.
2. Получите изображение мыши в виде разведчика, чтобы проверить их положение (используйте поле зрения 200 мм), и при необходимости отрегулируйте положение, перетащив поле поля обзора на интерфейсе. Нажмите «Начать рабочий процесс» в программном обеспечении сканера, чтобы начать компьютерную томографию, выбрав «Отображать интерактивные подсказки пользователя», чтобы можно было вручную запустить сканирование ПЭТ перед введением индикатора.

5. [¹¹C]DPA-713 Подготовка дозы

1. {{}}}TAG_341^}C]DPA-713, убедитесь, что вы носите соответствующие СИЗ (средства индивидуальной защиты) для борьбы с радиоактивностью, включая лабораторный халат, перчатки и индивидуальные дозиметры для пальцев и тела. Регулярно меняйте перчатки, чтобы предотвратить радиоактивное загрязнение, и по возможности увеличивайте расстояние от радиоактивного источника.
2. С помощью щипцов осторожно перенесите флакон с радиоиндикатором за свинцовый щиток.
3. Приготовьте шприцы с дозой 0,5 мл для каждой мыши, содержащие приблизительно 250-350 мкКи/9-13 МБк в объеме 100-200 мкл, чтобы обеспечить дозу, достаточную для 60-минутного динамического ПЭТ-сканирования (вводимая доза должна быть определена с учетом периода полувыведения изотопа и временной шкалы дизайна исследования, при этом объем зависит от веса мыши).
4. Измерьте активность с помощью калибратора дозы, установленного на C-11, расположенного в непосредственной близости от места канюляции, и запишите время измерения и инъекции для коррекции кариеса. Составьте дозы непосредственно перед окончанием КТ, чтобы ограничить распад и убедиться, что желаемый уровень радиоактивности будет введен каждой мыши.
5. Убедитесь, что в дозовом шприце нет пузырьков воздуха, прежде чем измерять активность и вводить ее каждой мыши.

6. Получение ПЭТ

1. Как только мыши автоматически перейдут от КТ к ПЭТ, настройте заднюю часть сканера для [¹¹C]Инъекция DPA-713 (Рисунок 1C). Положите защитную впитывающую прокладку на выступ и убедитесь, что ножницы и зажигалка находятся под рукой.
2. Перережьте запечатанную трубку катетера ножницами, убедитесь, что линии катетера свободны от пузырьков, и убедитесь, что канюля все еще находится в вене, выполнив промывку физиологическим раствором объемом 10-20 мкл. Загрузите шприцы с измеренной дозой, начиная с шага 5.4, в каждый из 4 катетеров, отслеживая, какая доза была введена каждой мыши.
3. Нажмите «OK», когда сканирование ПЭТ будет готово к запуску, одновременно запуская 10-секундный таймер. Пусть два исследователя будут находиться в задней части сканера со шприцами в руках, чтобы ввести все 4 мыши одновременно, когда таймер достигнет нуля. Промойте каждый катетер 50-100 мкл физиологического раствора (в зависимости от длины трубки катетера —, т. е. мертвый объем), чтобы убедиться, что полная доза попала в хвостовую вену, и снова запечатайте трубку с помощью зажигалки.
4. Измерьте дозу шприцев с помощью калибратора дозы, чтобы получить остаточное значение радиоактивности (любой индикатор, оставшийся в шприце). Обратите внимание на значения и время их записи.
5. После завершения сканирования приведите ПЭТ-кровать в исходное положение с помощью горизонтальной кнопки «Домой» на панели управления движением. Извлеките мышей из сканера и осторожно извлеките катетер. Аккуратно надавите на место канюляции, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение.
6. Измерьте остаточную активность в катетере с помощью калибратора дозы.
7. Если мышей необходимо выздороветь, убедитесь, что это делается в теплой среде (, например, в коробке с подогреваемой подушкой под ней или в перчатке, наполненной теплой водой), чтобы облегчить восстановление. Если вы планируете усыпить мышей, поместите их в индукционную камеру, содержащую изофлуран, чтобы они оставались под наркозом перед эвтаназией с помощью перфузии.
8. Чтобы восстановить данные, откройте программное обеспечение для управления постобработкой (см. Таблица материалов), которое автоматически восстановит каждое сканирование с использованием данных гистограммы, сгенерированных из файла lst.

7. Динамический анализ изображений ПЭТ

1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблица материалов) и нажмите на иконку "открытые данные", чтобы загрузить изображение КТ (в качестве источника) и иконку "добавить данные", чтобы загрузить динамическую ПЭТ (в качестве ссылки).

2. Выполните визуальный контроль качества данных с помощью оператора временных рядов в выпадающем меню: выберите эталон («ref») и «глобальный» и примените соответствующие минимальные и максимальные значения для цветовой шкалы. Визуализируйте динамические данные ПЭТ кадр за кадром, проверяя поглощение радиоактивности и проверяя наличие каких-либо искажений в процессе сканирования.

3. Создайте усредненное изображение ПЭТ с помощью «арифметического оператора».

1. Выберите "average selected", снимите флажок "ref" и убедитесь, что выбраны входные данные 1 ("Inp1"), ввод 2 ("Inp2") и входная звезда ("Inp*"-include остальные кадры PET в сканировании) для создания среднего значения всех кадров PET.

2. Перейдите на вкладку «Менеджер данных» (DM) и перетащите среднее изображение вверх до позиции «input1» для визуализации. Перераспределите цветовую шкалу, нажав на автоматический расчет в инструменте "min-max".

4. Зарегистрируйте КТ в среднестатистический файл ПЭТ с помощью функции «автоматический 3D» в выпадающем меню «переориентация/регистрация».

1. Выберите "ref" и "Inp1", и выберите "rigid", "fast", "Inp1 to Ref" регистрацию. Визуально проверьте регистрацию во всех 3-х измерениях и при необходимости вручную отрегулируйте во вкладке "ручное 3D" с помощью функций "перевод" и "вращение".

2. Когда регистрация будет удовлетворена, выберите "Inp2" и "Inp*", и примените ко всем рамкам PET, поставив галочку. Щелкните правой кнопкой мыши по файлам CT и PET в DM и сохраните как необработанные.

5. Обрезайте мозг одной мыши за раз для анализа мозга, используя компьютерную томографию в качестве руководства: выберите «обрезка» в выпадающем меню и перетащите границы изображения, чтобы обрезать голову мыши ниже ствола мозга. Переориентируйте изображения ПЭТ и КТ с помощью функции «ручная 3D-переориентация», как описано выше, чтобы череп был прямым во всех измерениях.

6. Загрузите MR-изображение для этой мыши (в формате DICOM) с помощью кнопки «Добавить данные» в верхнем левом углу интерфейса. Переместите МРТ с помощью «ручной 3D-переориентации» и подогнайте его к черепу в пределах КТ-изображения (убедитесь, что все модальности находятся в одной и той же ориентации).

7. Нарисуйте ROI обводки на MR-изображении с помощью инструмента «3D ROI».

1. Отключите визуализацию ПЭТ, сняв ее выбор на вкладке визуального контроллера (VC), и используйте только MR и CT для отображения ROI.

2. Нажмите на кнопку «Добавить ROI», чтобы создать новый ROI и назвать его «infarct». Выберите инструмент «сплайн», щелкните левой кнопкой мыши, чтобы нарисовать границу ROI, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы закрыть ее.

3. Повторите все срезы, охватывающие штрих, следя за тем, чтобы не захватить ни одну часть черепа в ROI, при этом лучше всего оставить воксельный зазор между границей черепа и ROI штриха.

8. Сгенерируйте контралатеральный ROI с использованием объема инфаркта.

1. Создайте новый ROI и пометьте его как «контралатеральный». Щелкните правой кнопкой мыши по ROI инфаркта и выберите «экспорт». Перетащите ROI в положение 2 («Inp1»).

2. Выбрав только "Inp1", примените сальто влево вправо с помощью функции "оператор" в меню "переориентация/регистрация". Поставьте галочку в поле «ROI», выберите «только просмотр» и вручную переместите новый ROI в идентичную область на контралатеральной стороне. Выберите оператор «арифметика» и примените скалярное умножение 2 к новому ROI, что позволяет независимо количественно оценить ROI.

3. Вернитесь к инструменту 3D ROI. Перейдите во вкладку «экспертные и экспериментальные» и нажмите на кнопку «импорт ROI». Выберите Inp1 в диалоговом окне, чтобы загрузить новый объем в качестве контралатерального ROI.

9. Щелкните правой кнопкой мыши по среднестатистическому изображению ПЭТ, выгрузите его и снова включите ПЭТ. Сгенерируйте количественные результаты поглощения с помощью значка «Экспортировать результаты» в инструменте 3D ROI.

10. При необходимости выполните дополнительный анализ расщепления мозга (т.е. автоматическое генерирование ROI областей правого и левого полушарий мозга с помощью модуля плагина 3D-мышиного атласа мозга для программного обеспечения Vivoquant).

1. Повторно загрузите зарегистрированные изображения ПЭТ/КТ.

2. Импортируйте атлас мозга мыши, нажав на меню «Расширенные модули» и выбрав инструмент 3D атлас мозга. Выберите «все регионы слева/справа» в «дополнительных настройках» и нажмите «выполнить», чтобы импортировать 3D-атлас.

3. Вручную поместите атлас в мозг, используя череп в качестве границы.

4. Повторно запустите атлас, убедившись, что отмечен флажок «импорт 3D ROI», чтобы создать электронную таблицу результатов для всех 14 ROI левого и правого полушария (продолговатый мозг, мозжечок, средний мозг, мост, кора головного мозга, гиппокамп, таламус, гипоталамус, стриатум, паллидум, обонятельные луковицы, мозолистое тело и белое вещество).

11. Количественно оцените поглощение индикатора в селезенке с помощью программного обеспечения сканера (см. Таблица материалов).

1. Загрузите файлы изображений ПЭТ и КТ, выделив их в базе данных и нажав на «общий анализ».

2. Перейдите на вкладку регистрации и совместно регистрируйте изображения ПЭТ и КТ, нажав на значок «жесткая регистрация».

3. Перейдите на вкладку «Количественная оценка ROI», нажмите на значок «создать ROI» и назовите его сплином.

4. Выберите инструмент «сфера» для построения ROI селезенки с помощью файла КТ для справки, гарантируя, что нет перекрытия с поглощением почек (с помощью изображения и сигнала ПЭТ во избежание распространения от почек).

5. Отредактируйте ROI, чтобы поддерживать одинаковые объемы ROI между животными.

12. Вычисление стандартного значения поправки для нормализации поглощения.

1. Загрузите данные ПЭТ/КТ из стандартного сканирования и создайте ROI цилиндра, охватывающего шприц объемом 20 мл, с помощью инструмента «ручная 3D ROI».

2. Получите уровень радиоактивности, содержащийся в пределах стандарта, с помощью значка таблицы.

3. Используйте этот результат нКи/куб. см и исходную зарегистрированную радиоактивность для стандарта (т. е. измерение стандарта калибратором дозы в нКи/куб. см) для создания поправочного коэффициента для значений поглощения ПЭТ. То есть, разделите радиоактивность стандарта, зарегистрированного калибратором дозы, на радиоактивность, рассчитанную по изображению стандарта на ПЭТ.

13. Используйте активность дозы и время измерений для распада с точностью до времени получения ПЭТ для всех мышей (т.е. рассчитайте активность дозы в начале сканирования ПЭТ).

14. Повторите эти действия для получения остаточных значений и вычтите из разложения скорректированную дозу, чтобы рассчитать точную активность, которую получило каждое животное.

15. После применения этой коррекции затухания также примените стандартную коррекцию, чтобы убедиться, что данные находятся на правильном уровне активности. Убедитесь, что эти поправки применены к полученным вручную результатам ROI и данным атласа мозга, относящимся к областям мозга для местоположения dMCAO (т. е. коре, гиппокампу и стриатуму).

16. Рассчитайте %ID/г для всех ROI, используя следующее уравнение: %ID/г = (радиоактивность ROI в нКи/куб. см / скорректированная доза на распад полученная в нКи/куб. см) x100. Построение графика %ID/g в зависимости от времени с помощью графического программного обеспечения для создания кривых временной активности для каждого ROI.

17. Используйте программное обеспечение для сканирования для окончательной визуализации изображения и создания фигуры. Нормализация изображений в соответствии с скорректированной дозой распада, полученной каждой мышью во время сканирования, гарантируя, что все изображения имеют одинаковую шкалу %ID/g.

ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для обеспечения точного сравнения изображений от разных мышей и/или изображений из исследований, проведенных в разные дни.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Inveon PET/CT сканер	Siemens	Version 4.2
программное обеспечение VivoQuant	InVicro	Version 2.5	Программное обеспечение для анализа изображений
Программное обеспечение Inveon Research Workspace	Siemens	Version 4.2	Программное обеспечение для работы сканера. Включает в себя microQView, программное обеспечение для управления постобработкой
Dose calibrator	Capintech	<
Typhoon Phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
Катетеры бабочек	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G игла
1 мл шприцев	BD
Инсулиновые шприцы	BD	329461	0.5 мл инсулиновых шприцев с иглой
20 мл шприца	VWR	BD302831	BD Slip Tip Graduate
Тканевый клей	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
Тепловая лампа	Fluker	27002	5.5" рептильная тепловая лампа с зажимом и выключателем
0.9% стерильный физиологический раствор	Pfizer	00409-4888-10	0.9% натрия хлорид для инъекций, 10 мл
Впитывающие простыни Chux	ThermoFisher Scientific	1420662	Одноразовая впитывающая прокладка
Ножницы для ирисов	World Precision Instruments	503708-12	11.5cm, прямой, 12-pack
Хирургическая лента	3M Durapore	1538-0	1/2"X10 ярдов рулон, шелк, гипоаллергенный
Мышь PET кровать	In house		4 мыши PET bed
Lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Изотезия, ингаляционный анестетик, 250 mL
Oxygen	Praxiar	Compressed gas
Смазка для глаз	Watson Rugby	PV926977	Artificial Tears Lubricant Eye Мазь, 1/8 унции

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>CRC-15 PET