Морфологический и физиологический мониторинг опухолевых сфероидов с помощью оптической когерентной томографии

Аннотация

Источник: Huang, Y. et. al., продольный морфологический и физиологический мониторинг трехмерных опухолевых сфероидов с использованием оптической когерентной томографии. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует использование оптической когерентной томографии (ОКТ) для мониторинга опухолевых сфероидов в многолуночном планшете путем получения изображений поперечного сечения с высоким разрешением. Анализируя отражения света от клеточных структур, ОКТ строит 3D-модели для оценки морфологических особенностей, таких как размер и форма, а также для различения жизнеспособных и нежизнеспособных клеток на основе изменений светорассеяния с течением времени.

Протокол

1. Подготовка клеток

1. Получите клеточные линии у квалифицированного поставщика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки из интересующих клеточных линий могут образовывать сфероиды в питательных средах или с помощью субстрата (матрицы базальной мембраны, такой как Матригель). Изучите литературу или проведите один раунд предварительного эксперимента для проверки.
2. Разморозьте замороженные клетки в соответствии с определенной процедурой, предусмотренной поставщиком клеточной линии. Общую процедуру можно найти в другом месте.
3. Культивируйте клетки по 1-2 пассажа по 25 см² колбы для культивирования. Затем клетки готовы к использованию для 3D-культивирования клеток.
4. Ежедневно контролируйте состояние клеток и поддерживайте их в инкубаторе в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂, влажность 95%). При необходимости обновите носитель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда состоит из модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) (4,5 г/л глюкозы), 1% антибиотик-антимикотик и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Субкультурные клетки до того, как они достигнут слияния в колбе с культурой. Следуйте рекомендациям по выращиванию клеточных культур, предоставленным поставщиком. Общую процедуру можно найти в другом месте.
5. Проведите 3D-культивирование клеток в многолуночных планшетах на основе следующего общего протокола.
   1. Извлеките питательную среду из питательной колбы и промойте ее стерилизованным фосфатно-солевым раствором (PBS, нагретым до 37 °C).
   2. Ресуспендируйте клетки путем добавления 1 мл трипсина этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 0,5%) в колбу на 3 мин. Затем добавьте питательную среду для разбавления трипсина.
   3. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут при температуре 500 x g и комнатной температуре.
   4. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 4 мл предварительно подогретой питательной среды. Пипеткой нанесите одну каплю образца на гемоцитометр для подсчета клеток, чтобы определить концентрацию клеток. Разбавьте клетки до концентрации, подходящей для затравки (e., 3,000 клеток/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте начальную концентрацию клеток сфероида для каждой клеточной линии и каждого типа многолуночной пластины (96-луночная, 384-луночная или 1536-луночная).
   5. Затравочные ячейки в многолуночную пластину с круглым дном со сверхнизким присоединением (ULA). Добавьте 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку в концентрации 3000 клеток/мл так, чтобы в каждой лунке было около 600 клеток.
   6. При комнатной температуре (RT) центрифугируйте всю пластину с помощью адаптера для планшетов в течение 7 минут, сразу после посева, со скоростью 350 x g или на самой низкой доступной скорости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифуга помогает собирать клетки в центре лунки, чтобы облегчить формирование единого однородного сфероида. Этап центрифуги выполняется только один раз в начале для формирования опухолевых сфероидов. Он не будет повторяться, когда опухолевые сфероиды начнут расти.
   7. Поддерживайте температуру в многолуночном планшете при температуре 37 °C и 5% CO₂ в инкубаторе для культивирования и обновляйте питательную среду каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время роста может варьироваться для разных условий 3D-культуры. В нашем исследовании для клеточных линий U-87 MG и HCT 116 в 96-луночных планшетах используется 3000 клеток/мл, так что сфероид может вырасти до ~500 мкм за 4\u20127 дней для клеток HCT 116. Основываясь на общем протоколе 3D-культивирования, рассмотрите возможность добавления медиадобавок и факторов роста для различных сфероидальных моделей.
   8. Проводите оптическую когерентную томографию (ОКТ) опухолевых сфероидов каждые 3–4 дня для лонгитюдного исследования их роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые временные точки для визуализации ОКТ: день 4, день 7, день 11, день 14, день 18 и день 21.

2. Высокопроизводительная платформа ОКТ-визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ:} См. Рисунок 1 для получения подробной информации о пользовательской системе визуализации ОКТ, используемой в этом исследовании.

1. Выберите подходящий широкополосный источник света для системы ОКТ для визуализации сфероидов опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь в качестве широкополосного источника света был использован сверхлюминесцентный диод (SLD, , B}) с центральной длиной волны ~1,320 нм и шириной полосы 110 нм.
2. Постройте опорное плечо и образец плеча системы ОКТ в соответствии со схемой (подробнее см. Рисунок 1A, B). Таблица Таблица{{}}{{TAG_258 TAG_259}} Материалы} перечисляет оптические компоненты, необходимые для создания системы ОКТ. Убедитесь, что длины оптических путей опорного плеча и плеча образца точно совпадают.
3. Соберите спектрометр, включающий коллиматор, решетку, объектив F-тета и камеру линейного сканирования (см. Рисунок 1C) для получения подробной информации о конструкции спектрометра ОКТ. В качестве альтернативы выберите коммерческий спектрометр, который соответствует центральной длине волны источника света. Убедитесь, что спектрометр выровнен правильно, чтобы охватить всю полосу лазерного излучения, достичь высокой эффективности сбора фотонов и обеспечить медленное размытие интерференционной картины.
4. Охарактеризуйте производительность системы ОКТ, включая следующие показатели, такие как мощность образца, общая глубина изображения, чувствительность, зависящая от глубины, осевое разрешение, глубина фокуса и боковое разрешение. Поместите слабый отражатель (, например, , зеркало с фильтром нейтральной плотности) в качестве образца для измерения чувствительности, зависящей от глубины, осевого разрешения и глубины резкости. Поместите цель тестовой карты ВВС США (USAF) в качестве образца для проверки бокового разрешения.
5. Выберите моторизованный столик для обеспечения горизонтального перемещения многолуночного планшета для визуализации опухолевых сфероидов в разных лунках (см. Рисунок 1B). Используйте столик с диапазоном перемещения более 108 мм x 72 мм, чтобы обеспечить полное сканирование всех лунок многолуночного планшета. Используйте двухмерный (2D) или трехмерный (3D) моторизованный столик трансляции с программным управлением, чтобы обеспечить точное определение местоположения каждой скважины и автоматизацию системы OCT для получения высокопроизводительной визуализации.
6. Используйте адаптер для пластин или сконструируйте держатель пластины (с помощью 3D-печати), чтобы удерживать многолуночную пластину в фиксированном положении.
7. Перед проведением любой ОКТ-визуализации откорректируйте наклон и вращение многолуночного планшета с помощью 2D-наклонного столика и поворотного столика, установленного на трансляционном столике (см. Рисунок{{}} 1D), чтобы свести к минимуму отклонение фокальной плоскости от разных лунок. Используйте D2, D11, B6, D6 и G6 в качестве направляющих скважин при мониторинге их взаимного положения на изображениях ОКТ (Рисунок 1A).
8. Отрегулируйте вращение пластины так, чтобы края были параллельны направлению движения стадии, чтобы лунки оставались в тех же горизонтальных положениях на изображениях ОКТ (Рисунок 1E). Отрегулируйте наклон пластины так, чтобы он был параллелен оптическому столу, чтобы лунки оставались в тех же вертикальных местах для визуализации ОКТ (Рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка угла наклона и фокусировки помогает оптимизировать качество изображения ОКТ для всех скважин. Однако изменения высоты питательных сред в разных лунках могут вызывать изменения в оптическом пути, что может привести к расфокусировке сфероидального изображения. Автофокусировка может быть реализована для управления фокальной плоскостью ОКТ-изображения для достижения оптимального качества изображения. Этап корректировки не устраняет плохое качество ОКТ-изображения опухолевого сфероида из-за следующих проблем: децентрация сфероида из-за начального места затравки; подъем сфероидов при встраивании в биоизготовленные внеклеточные матрицы; Плохое качество плит с большими вариациями высоты днищ скважин. Для оптимизации производительности системы ОКТ-визуализации может быть реализовано дополнительное программное управление с функциями автофокусировки или самовыравнивания.
9. Для последовательного сбора данных из каждой скважины специальная компьютерная программа управляет получением ОКТ-изображения и движением сцены.

3. ОКТ-сканирование и обработка опухолевых сфероидов

1. В день проведения ОКТ-визуализации опухолевых сфероидов извлеките многолуночный планшет из инкубатора. Перенесите его под систему визуализации ОКТ и поместите поверх адаптера пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ОКТ-визуализация опухолевых сфероидов может быть выполнена с закрытой или закрытой крышкой полистирольной пластины. Однако конденсация воды на крышке из-за испарения из скважин может повлиять на светопропускание и исказить световой путь, что приведет к менее оптимальным ОКТ-изображениям от сфероидов.
2. Отрегулируйте высоту пластины, перемещаясь по оси z ступени перевода. Поддерживайте положение фокальной плоскости на расстоянии ~100–200 мкм ниже верхней поверхности каждого сфероида, чтобы свести к минимуму эффект неравномерного профиля фокального профиля по глубине.
3. В пользовательском программном обеспечении установите правильный диапазон сканирования ОКТ (, например, 1 мм x 1 мм), чтобы охватить весь сфероид опухоли в соответствии со стадиями его развития. Нажмите Сохранить параметры, чтобы сохранить настройки.
4. Используйте специальное программное обеспечение для получения 3D ОКТ-изображений опухолевых сфероидов один за другим для всех лунок пластины, содержащих сфероиды. Нажмите кнопку Preview, чтобы просмотреть изображение, и нажмите кнопку Acquire, чтобы получить изображение OCT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что данные сфероида OCT собраны, когда сцена не находится в движении. Сфероид обычно расположен в центре U-образной нижней лунки. Однако сфероид может смещаться в питательной среде при ускорении или замедлении ступени из-за инерции сфероида в питательных средах.
5. Обрабатывайте 3D-наборы данных ОКТ опухолевых сфероидов для создания структурных изображений ОКТ с помощью пользовательского кода обработки C++. Смотрите Рисунок 2A} для блок-схемы постобработки данных ОКТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 3A} для сгенерированных 3D ОКТ-структурных изображений.
   1. Откалибруйте размер пикселя во всех трех измерениях. Измените масштаб структурных изображений ОКТ на скорректированные масштабы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние в осевом направлении (z-направлении) ОКТ-изображений измеряет разницу оптических путей между эталонным плечом и плечом образца. Таким образом, показатель преломления образца (n) необходимо учитывать при калибровке размера пикселя в осевом направлении для масштабирования. В нашем исследовании мы используем n = 1,37 в качестве показателя преломления сфероида опухоли.
6. Создание коллажа из сфероидальных изображений с помощью 2D ОКТ-изображений в трех плоскостях поперечного сечения XY, XZ и YZ по центроиду сфероида. Смотрите Рисунок 4C–E для репрезентативного вывода коллажей сфероидных изображений. Выполните регистрацию изображений для всех сфероидов с помощью функции dftregistration MATLAB, чтобы убедиться, что центроиды всех сфероидов расположены примерно в одном и том же месте.
7. Получите 3D-рендеринг сфероида с помощью коммерческого или заказного программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги показывают, как получить 3D-рендеринг опухолевых сфероидов с помощью коммерческого программного обеспечения.
   1. Загрузите данные 3D OCT в программное обеспечение.
   2. Нажмите на панель Surpass{. Затем нажмите Добавить новый том. Выберите режим Blend} для использования для 3D-рендеринга.
   3. Отрегулируйте угол обзора, перетаскивая изображение с помощью указателя мыши.

4. Морфологическое количественное определение 3D опухолевых сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательский код в MATLAB обрабатывает эту количественную оценку. Нажмите кнопку Run), чтобы начать процесс. Смотрите Рисунок 2B} для блок-схемы этапов морфологической количественной оценки сфероидов.

1. Количественная оценка диаметра, высоты и объема сфероида на основе диаметра.
   1. Выберите 2D ОКТ-изображения в трех плоскостях поперечного сечения XY, XZ и YZ, которые пересекают центроид сфероида.
   2. Измерьте диаметр и высоту сфероида в плоскостях XY и XZ соответственно.
   3. Рассчитайте объем сфероида на основе диаметра с помощью:

, с предположением о сферической форме опухоли.

2. Количественная оценка объема сфероида на основе вокселов.
   1. Примените фильтр 3D-усреднения к структурным данным ОКТ сфероида, чтобы удалить зернышки.
   2. Сегментируйте опухолевые сфероиды с помощью фильтра Canny edge detection, кадр за кадром, с правильным порогом, отделяющим область сфероида опухоли от дна лунки.
   3. Группировка соединительных вокселей для 3D-данных (см. встроенную функцию: bwconncomp).
   4. Вычислите среднее расстояние между каждым соединительным вокселом в группе и центроидом сфероида (выбранным вручную) для каждой группы. Определите область сфероида как группу с минимальным средним расстоянием.
   5. Подсчитайте количество вокселей в области сфероида, а затем умножьте на фактический объем отдельного воксела (объем/воксель), получив общий объем сфероида.

5. Обнаружение сфероидов 3D-опухолей в области мертвых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ:} В однородной среде интенсивность обратного рассеяния ОКТ обнаруживается как функция глубины (I(z}) может быть описана Закон Бера-Ламберта:

Где z{{}} представляет глубину, }μ{{}} - коэффициент оптического затухания, и I0 - интенсивность падения на образец. Следовательно, полученный коэффициент оптического затухания может быть выражен следующим образом:

Поскольку изображения ОКТ часто строятся в логарифмической шкале, для получения коэффициента оптического затухания можно получить наклон профиля интенсивности ОКТ. Смотрите Рисунок 2C} для блок-схемы создания карт оптического затухания.

1. Выполните сегментацию для удаления нежелательных областей за пределами сфероида. Используйте фильтр 3D усредненных, чтобы подавить зернистый шум, присущий ОКТ-изображениям.
2. Получите попиксельные коэффициенты оптического затухания путем линейной аппроксимации логарифмического профиля интенсивности ОКТ в определенном диапазоне глубин (движущемся окне), извлечения его наклона и умножения наклона на -1/2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент затухания на каждом вокселе в сегментированной области сфероида рассчитывается на основе наклона профиля интенсивности ОКТ в окне глубины 10 вокселей (~40 мкм в глубину), где воксель расположен в середине окна.
3. Применяйте описанные выше методы (шаги 5.1 и 5.2) к каждому осевому сканированию в кадре и к каждому кадру в наборе 3D-данных, содержащем сегментированную сфероидальную область, до тех пор, пока не будут рассчитаны оптические коэффициенты затухания для всех вокселей сегментированной сфероидальной области.
4. Выполните двоичное пороговое значение, чтобы выделить область с высоким затуханием.
   Выделите карту бинаризованного оптического затухания на исходном изображении, чтобы пометить область мертвых клеток (смешивание). Сгенерируйте 3D-визуализированное изображение смешанной карты затухания, чтобы визуализировать 3D-распределение области мертвой клетки.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пользовательская система визуализации ОКТ в спектральном домене			Разработана в нашей лаборатории
} Суперлюминесцентный диод (SLD)	Thorlabs	}SLD1325	}{{}}
2×2 одномодовый оптоволоконный соединитель, 50:T50 коэффициент разделения	AC Photonics	WP13500202B201	}
Эталонная рука
Трубка объектива	}Thorlabs
Thorlabs
}Коллиматорная линза	Thorlabs	AC080-022 0-C
Фокусирующий объектив	Thorlabs
Thorlabs		}
Зеркало	Thorlabs	{{}} {{}}}{{}}{{}}{{}}}Зеркало{{}}{{}}Thorlabs{{}}{{}}} {{}}}{{}}} {TAG_107}}
1D Translational Stage	Thorlabs
Thorlabs
}Пейдральный пост	Thorlabs
}Зажимная вилка	Thorlabs	}
Образец руки			}
}Трубка объектива	Thorlabs
Адаптер	Thorlabs
Коллимационная линза	Thorlabs	AC080-020-C	}
}{{}}Гальванометр	Thorlabs{{}} TAG_195{{TAG_196 TAG_197}}
	Thorlabs	AC254-100-C	Два релейных объектива для создания телескопа setup
Треугольное крепление для зеркала	Thorlabs
Зеркало
Objective	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
Педенальный пост	Thorlabs
Зажимная вилка
Контроллер поляризации	}Thorlabs		{{ TAG_269}}
33-мм крепление для клетки	Thorlabs
Стержень в клетке
		{{ TAG_299}}
3D моторизованная сцена перевода	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co. , Ltd.	JTH360XY
2D Наклонная сцена	}	}	}
	{{TAG_ 325}}
Держатель тарелки			3D-печать
Спектрометр		}
Трубка объектива	Thorlabs{{TAG_ 355}}
Адаптер	}Thorlabs	}
Коллимационный объектив	Thorlabs	AC080-020-C	}
Решетка	Wasatch	G = 1145 lpmm
F-тета объектива	Thorlabs	FTH-1064-100
InGaAs камера линейного сканирования	Sensor Unlimited	SU1024-LDH2
Компонент клеточной культуры{{TAG_ 414}}
HCT 116 Клеточная линия	ATCC	CCL-247	{{TAG_431 TAG_432}}{{}}
Колба для клеточных культур	SPL Науки о жизни	}70025
Пипетка	Fisherbrand	14388100
}Наконечники для пипеток	Sorenson Bioscience	10340
Gibco GlutaMax DMEM	}Thermo Fisher Scientific	10569044	}
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, происхождение из США	Thermo Fisher Scientific	16000044	}
Антибиотик-антимикотик (100X)	}Thermo Fisher Scientific	{{}}{{TAG_489}15240062}	}
Corning 96-луночный прозрачный круглый дно сверхнизкое крепление микропластина	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	}
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Series II 3110 Инкубатор с водяной рубашкой CO2	Thermo Fisher Scientific	3120
Перчатки	VWR	89428-750
Парафильм	Сигма-Олдрич{{ TAG_555}}	P7793
Перенос пипетов	Globe Scientific	138080
Центрифуга	Eppendorf	5702 R	Для центрифугирования пробирки объемом 15 мл
Центрифуга{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Для центрифугирования 96-луночного планшета
{{}}Микроскоп	Olympus
Список коммерческих ОКТ	}
SD-OCT система	Thorlabs	}	}
} Система SD-OCT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 нм	}
Программное обеспечение для анализа данных{{TAG_ 637}}			}
}Базовый анализ изображений	NIH	ImageJ	Фиджи также работает.
3D рендеринг	Thermo Fisher Scientific	Amira	Коммерческое программное обеспечение. Вариант 1
3D рендеринг	Bitplane	Imaris	Коммерческое программное обеспечение. Вариант 2. Используется в протоколе
Программное обеспечение для сбора данных OCT	}		, специально разработанное на C++.
Управление сценой	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Включено в пользовательский код регистрации ОКТ
Программное обеспечение для обработки ОКТ	}		Специально разработано на C++. Используйте графический процессор. Включается в пользовательский код получения ОКТ.
Морфологический и физиологический анализ			Специально разработано в MATLAB

{{ TAG_62}}Адаптер{{TAG_ 92}}Кинематическое крепление для зеркала{{ TAG_122}}Непрерывный фильтр нейтральной плотности{{TAG_136{ 5}} {{ TAG_151}}{{ TAG_166 43} {{TAG_ 181}}{TAG_224}}Thorlabs{{ TAG_254 63}Thorlabs{TAG_284}}Thorlabs{{}}{{TAG_292 TAG_293}}{{}} }{{}}} {{}}{{}} {{}}{{}}{{}}{{}}{{}}}{{} {{}}{} {{}}{{}}{{}}{{}}{{}}} {{}}{{}}} {{}}{{}}{{}}{{}}}{{}}} {{}}{}}} {{}}{{}}{}}{{}}{{TAG_ 386}} {{ TAG_400{{}}{{TAG_ 473}}{{}}{{}TAG_512}{{}}{{ TAG_540 43}{{}} }} {{ TAG_610}} {{}}