В этом видео демонстрируется визуализация полисом с помощью атомно-силовой микроскопии. Покрытый ионами никеля лист слюды закрепляет РНК с прикрепленными рибосомами. Образец промывают, сушат и устанавливают на предметный столик микроскопа. Консольный наконечник сканирует поверхность образца, регистрируя лазерные прогибы для картографирования топологии. Программное обеспечение используется для коррекции искажений и визуализации полисомных структур с высоким разрешением.
Протокол
Внимание: Чтобы избежать деградации РНК образцов, подготовьте все буферы, используя воду, обработанную DEPC, чтобы свести к минимуму загрязнение РНКазой.
1. Получение полисом из цельного мозга
Сбор тканей мозга (15 мин)
Эвтаназия мышей дикого типа C57BL/6 с CO2 удушье в течение 5 мин. Аккуратно рассеките мозг из черепа, поместите ткань в пробирку объемом 1,5 мл и сразу же поместите ее в жидкий азот. Хранить при температуре -80 °C до использования.
Приготовление лизата (30 мин)
Измельчите всю ткань мозга с помощью ступки и пестика под жидким азотом.
Переложите около 25 мг порошка в холодную микроцентрифужную пробирку и сразу же (во избежание размораживания измельченной ткани) добавьте 0,8 мл буфера для лизиса (см. Таблицу 1{{}TAG_65}) ) и нарушьте работу клетки, быстро пипетируя вверх и вниз 25 раз.
Центрифугируйте пробирку при давлении 12 000 x g в течение 1 минуты при 4 °C для удаления клеточного мусора.
Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку и подержите пробирку на льду в течение 15 минут.
Центрифугируйте пробирку при давлении 12 000 x g в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования ядер и митохондрий.
Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.
Храните надосадочную жидкость при температуре –80 °C не более 6 месяцев или используйте немедленно.
Приготовление градиента сахарозы и центрифугирование (2 часа 30 минут)
Тщательно промойте ультрацентрифужные пробирки водой, не содержащей РНКазы (вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC-вода) или коммерческая) и 3% H2}O2{{TAG_119 TAG_120}}/DEPC H2{{TAG_ 126}}O решение.
Положите пробирки на лед и добавьте на дно каждой пробирки 5,5 мл холодного 50% раствора сахарозы (см. Таблица 1 для растворов сахарозы). Осторожно добавляйте 15% раствор сахарозы по каплям, оставаясь близко к интерфазе, чтобы сохранить резкую интерфазу до полного заполнения пробирки. Когда трубка будет полностью заполнена, закройте ее резиновой пробкой, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
В холодном помещении аккуратно уложите трубки горизонтально и подержите в таком положении 2 часа. По истечении этого времени медленно расправьте трубки обратно в вертикальное положение и положите их на лед. Теперь градиенты готовы к использованию. В качестве альтернативы приготовьте градиент сахарозы 15-50% с помощью обычного формовщика градиента.
В холодном помещении осторожно снимите 1,0 мл с верхней части градиента и капля за каплей покройте сахарозу цитозольным лизатом (т.е. надосадочной жидкостью, полученной на шаге 1.2).
Осторожно опустите трубки в ведра качающегося ротора ковша. Центрифугируйте градиенты в течение 100 мин при 180 000 x g при 4 °C с помощью ультрацентрифуги.
}После центрифугирования оставьте пробирки в ведре на 20 минут при температуре 4 °C, чтобы стабилизировать градиенты.
Фракционирование градиента сахарозы (2 часа)
Осторожно извлеките одну ультрацентрифужную пробирку из ротора ультрацентрифуги и установите ее на коллекторное устройство системы фракционирования градиента плотности. Соберите фракции объемом 1 мл для контроля поглощения на длине волны 260 нм с помощью УФ/ВИД детектора (см. Рисунок 1 верхняя панель). Собранные фракции держать на льду.
Приготовьте аликвоты по 30-40 мкл интересующих фракций. Держите их на льду перед хранением при температуре -80 °C до использования. Не используйте аликвоты или фракции сахарозы, которые прошли более двух циклов замораживания-оттаивания (см. Рисунок 1 нижний панель).
2. Подготовка образцов для атомно-силовой микроскопии (3 часа)
С помощью ленты снимите листы слюды.
Промойте листы слюды 3-4 раза водой DEPC и поместите их в небольшую чашку Петри. Затем высушите поверхность с помощью воздуха.
Налейте на слюду 200 мкл 1 мМ NiSO4 и инкубируйте в течение 3 минут при RT.
{{}}}Удалите раствор никеля, а затем высушите поверхность воздухом. Выполняйте все последующие действия при температуре 4 °C, положив чашку Петри со слюдой на лед.
Разморозьте аликвоту, полученную в 1.4.2, на льду и аккуратно добавьте весь образец по каплям в слюду. С помощью наконечника объемом 100-200 мкл распределите образец по всей поверхности слюды. Инкубируйте образец на льду в течение 3 мин.
Покройте лист слюды по каплям 200 мкл холодного буфера-AFM(см. {} Стол 1) и инкубируйте в течение 1 часа на льду.
Визуализация в жидкости
Осторожно извлеките буферно-атомно-силовой микроскоп (АСМ) и промойте листы слюды 3-4 раза холодным буфером-АСМ объемом 200 мкл, чтобы удалить избыток сахарозы. Затем промойте листы слюды 3 раза холодным моющим раствором (см. Таблица 1), оставив поверхность слюды покрытой несколькими микролитрами раствора.
Перейдите к пункту 3 (Получение изображения).
Визуализация на воздухе
Осторожно снимите Buffer-AFM и промойте слюду 3-4 раза холодной Buffer-AFM объемом 200 μl, чтобы удалить излишки сахарозы. Затем промойте слюду 3 раза холодным моющим раствором (см. Таблица 1) и слейте лишнюю воду с помощью бумаги.
Оставьте образец сохнуть под химическим колпаком с частично открытой верхней частью чашки Петри. Через 2 часа закройте чашку Петри и храните ее при комнатной температуре (RT). Измеряйте образцы через 2-3 часа, так как они стабильны в течение многих лет.
3. Получение изображения (15 минут на изображение после термостабилизации)
Примечание: Полисомы, иммобилизованные на слюде, могут быть изображены в воздухе или в жидкости в режиме переменного тока.
Прикрепите слюду к держателю для образцов с помощью двустороннего скотча.
Вставьте держатель образца в столик АСМ, следуя указаниям производителя. При визуализации в жидкости, по возможности, старайтесь поддерживать температуру образца ниже 25 °C, чтобы со временем увеличить стабильность полисом.
Выберите консоль, подходящий для визуализации переменного тока, и установите его на держатель наконечника, следуя инструкциям производителя. Здесь используйте кантилеверы с постоянной силы в диапазоне от 2 до 20 Н/м для воздушной съемки и около 0,1 Н/м для жидкостной визуализации.
Отрегулируйте лазерное пятно на консольном аппарате и обнулите сигналы детектора в квадранте.
Выберите удобную частоту движения и приводите в движение консоль с амплитудой 10-20 нм.
Приближайтесь к образцу до тех пор, пока наконечник не войдет в контакт с поверхностью.
Выберите область сканирования 2x2 мкм, получите изображения размером не менее 512x512 пикселей (ширина пикселя < 4 нм), а также выберите режим вычитания фона в реальном времени и масштаб Z 20-25 нм.
Осмотрите изображение на наличие круглых объектов, характеризующихся высотой от 10 до 15 нм при получении изображения на воздухе и 25 и 30 нм при нахождении в жидкости и шириной в диапазоне 25-30 нм. Регулируйте заданное значение и параметры обратной связи до тех пор, пока не будут визуализированы острые объекты. Фон должен выглядеть относительно плоским в хороших образцах, с некоторыми объектами высотой 2-4 нм (см. Рисунок 2A и B).
Если изображение выглядит хорошо (как указано в пункте 3.8), сделайте несколько (не менее десяти) сканов размером 2x2 микрона на разных участках образца.
(необязательно). При необходимости получить изображения выбранных полисом с высоким разрешением (см. Рисунок 2C).
Применяйте программные коррекции (алгоритмы вычитания плоскости и построчной коррекции) для коррекции изображений АСМ, устраняя произвольные эффекты наклона и дрейфа.
4. Анализ данных (30 минут на изображение)
Экспортируйте изображения в ImageJ (опционально: примените коэффициент масштабирования) преимущественно с использованием формата сжатия без потерь, например, формат TIFF (см. Рисунок 3A).
Используйте набор инструментов макросов ImageJ RiboPick.ijm (который будет скопирован в подкаталог макроса/набора инструментов ImageJ) для подсчета рибосом в полисомах (см. Рисунок 3B) и вычислите статистические свойства образца (см. Рисунок 3C).
Начните загрузку изображения с помощью инструмента <Чтение изображения> который инициализирует программу.
Выделите центры рибосом с помощью стандартного инструмента ImageJ <Точечное выделение> (shift + щелчок левой кнопкой мыши позволяет многократно выделить рибосомы). Отметьте выбранные рибосомы с помощью инструмента <Отметьте рибосомы> Координаты рибосом появятся в пользовательском текстовом окне.
Добавьте к той же полисоме еще несколько рибосом, повторив процедуру, указанную в пункте 4.2.2.
Удалите неправильно помеченные рибосомы с помощью инструмента <Отменить последний выбор> (начните удаление с последней добавленной рибосомы в первую — только в текущей полисоме).
Когда полисома будет готова, воспользуйтесь инструментом <Новая полисома> . Когда полисомное число добавляется в качестве наложения на изображение, текстовое окно обновляется.
Используйте <Сохранить результаты и закрыть> чтобы записать файл координат рибосом (используются единицы измерения изображения по умолчанию) и изображение в формате PNG, которое суммирует выбранные рибосомы и полисомы. Исходное изображение закрывается без сохранения.
Таблица 1. Буферов.
{{TAG_978 TAG_980}}100 μг/мл циклогексимид
Буфер
Состав
} Приложение
Буфер для лизиса
{TAG_547}}{{ TAG_548}}
10 мМ Трис–HCl, pH 7.5
}Получение лизата (1.1)
}
TAG_572}{{}}}{{}}}
} {{TAG_ 577}}
10 mM MgCl2
1% Triton-X100
}
1% Na-дезоксихолата{
}
0.4 Ингибитор РНКазы
}
{{ TAG_641}}
1 mM DTT
}
0.{{}}0.{{}}0.2 мг/мл циклогексимид
{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
}
50% раствор сахарозы [}}
50% (в/в) сахарозы в
Сахароза Подготовка градиента (1.Подготовка к градиенту 2)
10 мМ Tris/HCl pH 7.}}{{}}{{}}{{}}10 мМ Tris/HCl pH 7.}}{{}}{{}}{{}}10 мМ Tris/HCl pH 7.10 мМ Tris/HCl pH 7.}}{{}}{{}}{{}}10 mM Tris/HCl pH 7.10 mM Tris/HCl pH 7.}}}{{}}{{}}{{}}}{{}}10 мМ Tris/HCl pH 7.}}{{}}{{}}{{}}10 мМ Tris/HCl pH 7.}{{}}{{}}{{}}10 mM Tris/HCl pH 7.}}{{}}{{}}{{}}10 mM Tris/HCl pH 7..10 mM Tris/HCl pH 7.}}{{}}{{}}{{}}10 mM Tris/HCl pH 7.}}{{5
