Микрокомпьютерная томография с контрастным усилением поражений кавернозной мальформации головного мозга мышей

Аннотация

Источник: Choi, J. P. et et al. Индукция и микрокомпьютерная томография кавернозных мальформаций головного мозга на мышиной модели. J. Vis. exp. ( 2017)

Это видео демонстрирует использование микрокомпьютерной томографии для визуализации поражений церебральной кавернозной мальформации (CCM) в мозге мыши. В нем подробно описаны этапы подготовки образцов, визуализации и реконструкции 3D-изображений для оценки плотности и расположения поражений КМК в ткани головного мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка образцов для микрокомпьютерной томографии (КТ)

1. Эвтаназия новорожденных щенков в точке P8 с помощью удушения углекислым газом.
2. Выполните внутрисердечную перфузию путем введения иглы 29-го калибра с 3 мл 2% параформальдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS) в шприц объемом 10 мл в желудочек сердца мыши.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен; носить соответствующую защиту.
3. Отделите голову от туловища с помощью ножниц. Снимите всю кожу с головы с помощью ножниц и снимите череп с помощью щипцов, чтобы препарировать весь мозг.
4. Сделайте снимки мозга с помощью стереомикроскопа с увеличением 7,82x, коэффициентом усиления 1x, гаммой 0,6 и временем экспозиции 20 мс.
5. Вскрыть рассеченный мозг с помощью 4% параформальдегида в растворе PBS на ночь.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен; носить соответствующую защиту.
6. На следующий день отсоедините задние мозги с помощью щипцов и промойте раствором PBS.
7. Инкубируйте задний мозг в растворе йода Люголя в течение 48 ч.
8. После инкубации кратковременно высушите задний мозг на воздухе, чтобы удалить избыток раствора йода Люголя.
9. Упакуйте окрашенный йодом задний мозг Люголя в микроцентрифужные пробирки объемом 0,65 мл и полностью запечатайте пластиковой парафиновой пленкой, чтобы избежать усадки тканей (Рисунок 1A).
10. Поместите микроцентрифужные пробирки в пластиковые пробирки объемом 5 мл с губками, чтобы они не двигались во время сканирования (Рисунок 1B).

2. Микрокомпьютерная томография кавернозных мальформаций головного мозга (КМК) в мозге мыши

1. Вертикально установите задний мозг, упакованный в трубку, на алюминиевый держатель в системе микро-КТ.
2. Установите параметры сканирования равными 540 проекциям и времени экспозиции 2 с при источнике 50 кВ и 10 Вт для получения томографических наборов данных (разрешение изображения 9,5 мкм/пиксель).
3. Рентгенограммы сканирования автоматически восстанавливаются с помощью аппаратного программного обеспечения для реконструкции проекции, поставляемого системой микро-компьютерной томографии, создавая серию изображений 16-битных осевых срезов (файл «TXM»).

3. Анализ наборов данных микро-компьютерной томографии

1. Откройте восстановленный файл изображения (файл "TXM") в программном обеспечении для 3D-анализа и визуализируйте мозг с помощью функции "объемного рендеринга".
2. Трансформируйте задний мозг в нужную ориентацию с помощью функций «ограничивающий прямоугольник» и «плоскость обрезки».
3. Измените разрешение преобразованного изображения в расширенном режиме и сохраните размер воксела.
4. Создайте "редактировать новое поле метки" на преобразованном изображении (3.3) и выделите только задний мозг с помощью интенсивности оттенков серого.
5. Добавьте выделенные области и запустите "анализ меток", чтобы получить измерения всего заднего мозга (т.е., общий объем и площадь). Экспорт измерений в файл Excel.
6. Визуализируйте задний мозг с помощью функции «рендеринг изоповерхности».
7. Создайте еще одно поле «Редактировать новую метку» на преобразованном изображении и выделите области с поражениями с помощью интенсивности оттенков серого.
8. Добавьте выделенные области и запустите анализ "метки", чтобы получить измерения поражений в заднем мозге (т.е., общий объем и площадь). Экспорт измерений в файл Excel.
9. Визуализируйте поражения с помощью функций «создать поверхность» и «посмотреть поверхность».
10. Сделайте снимки заднего мозга в желаемой ориентации или создайте фильм для 3D-визуализации поражений.

Результаты

Рисунок 1: Подготовка образцов и реконструированные 2D-изображения.

Материалы