Двойная флуоресцентная визуализация для идентификации дифференцированных олигодендроцитов

Аннотация

Источник: Шотт, Д. Т., и др. Получение культур-предшественников олигодендроцитов крыс и количественная оценка олигодендрогенеза с помощью двухинфракрасного флуоресцентного сканирования. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует использование двойной флуоресцентной визуализации для оценки дифференцировки олигодендроцитов из клеток-предшественников (OPC), выделенных из мозга детеныша крысы. Процесс включает в себя фиксацию клеток, мечение специфических маркеров первичными и флуорофор-конъюгированными вторичными антителами, а также их визуализацию с помощью флуоресцентной визуализации. Идентифицированы дифференцированные олигодендроциты, экспрессирующие как основной белок миелина (MBP), так и фактор транскрипции олигодендроцитов 2 (Olig2), что отличает их от недифференцированных клеток-предшественников, экспрессирующих только Olig2.

Протокол

1. Подготовка пробирных пластин, стоковых растворов и OPC Base Media

Note:

Ресуспендировать поли-L-лизин (PLL) до концентрации 10 мкг/мл в стерильной деионизированной воде. Пипеткой внесите 400 μл разведенного ФАПЧ в каждую лунку 24-луночной чашки с черными стенками и прозрачным дном для культуры тканей.

N-Ac-Ac-цистеин (NAC) стоковый раствор (1,000x): Растворите 100 мг N-Ac-Ac-Ac-Ac в 20 мл модифицированного Eagle's medium (DMEM) от Dulbecco). Аликвот и хранить при температуре -20 °C.

Приготовьте стоковый раствор прогестерона (25 мкг/мкл): растворите 2,5 мг прогестерона в 100 мкл этанола.

2. Индукция дифференциации и фиксации OPC с помощью 4% параформальдегида

Note:

Предварительно нагрейте базовый носитель OPC до 37 °C и разморозьте запасы для лечения лекарств до комнатной температуры. При проведении процедур в двух экземплярах приготовьте примерно 1,25 мл среды на группу лечения в пробирке объемом 1,5 мл. Для тройных образцов используйте центрифужные пробирки емкостью 2 мл, чтобы компенсировать провисание.

₃₃⁺ культуру через 4 дня в дифференцировочные среды.

ВНИМАНИЕ:²⁺²⁺3. Иммуноцитохимия и количественная оценка основного белка миелина

Note:

Доведите пластину до комнатной температуры, отасуньте лунки и добавьте 250 μl D-PBS (with Ca²⁺ и Mg<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400; text-decoration:none;vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>²⁺), содержащий 0,1% Triton X-100 и 5% обычной сыворотки козы (NGS). Инкубировать планшет при комнатной температуре в течение 1 часа с легким встряхиванием орбиты.

²⁺ и Mg<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺), содержащий 5% NGS. В качестве альтернативы, кроличий поликлональный анти-Olig2 в соотношении 1:1000 может быть использован для нормализации специфичных олигодендроцитов в смешанных глиальных культурах. Приготовьте достаточное количество первичного раствора для размещения 250 μл на лунку.

²⁺²⁺) при комнатной температуре с легким орбитальным встряхиванием.

²⁺ и Mg<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺), содержащий 5% NGS. При приготовлении этого решения сведите к минимуму воздействие окружающего света.

²⁺²⁺) при комнатной температуре с легким орбитальным встряхиванием.

Используя программное обеспечение, установите режим анализа пластин на "24 Well" и выровняйте круги по внешнему периметру отсканированных лунок. Установите канал нормализации на "800" и экспортируйте общую и относительную интенсивности флуоресценции для каналов 700 нм (MBP) и 800 нм (Olig2/Actin).

Материалы

11995-065

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 нг/мл
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
	Sigma-Aldrich	T6397td
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Соль гемифумарата кветиапина	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-ацетил цистеин<	A9165	5 μg/mL
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 нг/мл
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich<	16 μg/mL
Селенит натрия	Sigma-Aldrich	S5261	40 нг/мл
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 нг/мл
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639		Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	1 x
24-well Black Visiplate с крышкой	Перкин Элмер	1450-605	Tissue culture grade
<
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Нормальная козья сыворотка	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 Разбавление
кролик поликлональный анти-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
кролик поликлональный анти-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 козий анти-мышь	Life Technologies <3px	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:000 разбавление
Продлите защиту золота с помощью DAPI	Life Technologies	P36931	<
DPBS with Ca2+ и Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor	<

style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>45 nMtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-Aldrichtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>P7505td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> ;td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>A11032tr style='height:21px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>